清润养目口服液对干眼兔模型结膜炎性细胞表达的影响

2016-12-06郑燕林姚曼彭晓丽陈廷郑淼王毅

中国中医眼科杂志 2016年1期

郑燕林姚曼彭晓丽陈廷郑淼王毅

·论著：实验研究·

郑燕林1姚曼2彭晓丽3陈廷3郑淼3王毅4

目的探讨清润养目口服液对兔暴露性干眼模型结膜炎性细胞表达的影响。方法将16只健康日本大耳白兔随机分为4组：正常组、模型组、高剂量组、低剂量组，正常组不做任何处理，其余3组采用缝线法联合第三眼睑部分摘除方法造模；高、低剂量组每天分别予2.3 ml/kg、0.575 ml/kg的清润养目口服液灌胃，模型组每天以等量生理盐水灌胃，连续灌胃28 d。各组分别于造模前，造模后即刻、2周、4周行角膜荧光素染色（CFS）、泪膜破裂时间（BUT）、泪液分泌量检查（SIT）。造模后28 d处死动物，经HE染色观察清润养目口服液对兔结膜炎性细胞表达的影响。结果（1）CFS、BUT、SIT：造模后2周，高、低剂量组及模型组的CFS评分、BUT、SIT较造模后即刻均有不同程度的改善（P＜0.05），高、低剂量组好于模型组（P＜0.05）。造模后4周，高、低剂量组上述三项指标较造模后2周进一步改善（P＜0.05），并好于模型组（P＜0.05），其中BUT、SIT结果与同期正常组接近（P＞0.05），高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）病理组织学检查：正常组，结膜组织内未见明显炎性细胞浸润；模型组、高剂量组、低剂量组实验兔结膜组织中均有不同程度的炎性细胞的表达，穹窿部炎性细胞的表达均强于球结膜部。高、低剂量组球结膜部炎性细胞表达明显弱于模型组（P＜0.05）。结论清润养目口服液可以减轻暴露性干眼模型兔的结膜炎症反应，其对干眼的治疗作用可能与此有关。

干眼；清润养目口服液

干眼（dry eye）是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常，导致泪膜不稳定和（或）眼表面的异常，并伴有眼部不适症状的一类疾病〔1〕。在干眼众多的病因及临床表现中，炎症成为了不可忽视的致病因素。本研究所用清润养目口服液主要在临床上用于治疗干眼，本实验旨在观察清润养目口服液对兔暴露性干眼模型结膜炎性细胞表达的影响，从而探讨该口服液治疗干眼的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取16只健康日本大耳白兔[动物合格证号：scxk（川）2013-14]，雌雄不限，体质量在2.0～2.5 kg之间，经裂隙灯检查眼前节无异常者。随机分为4组，正常组、模型组、高剂量组、低剂量组，每组4只（8只眼），正常组不做任何处理，模型组、高剂量组、低剂量组进行造模。

1.2 主要试剂药品及实验仪器

清润养目口服液（主要药物组成：北沙参、黄精、枸杞子、菊花等，由成都中医药大学附属医院药剂科提供，批号：20121130）、75%乙醇、荧光素钠溶液、泪液检测滤纸条、盐酸丙美卡因滴眼液、FAA固定液（成都中医药大学附属医院病理科提供）、电子秤、电子天平、眼科手术显微镜、眼科显微手术器械、双目生物显微镜（OLYMPUS）。

1.3 动物模型的制作

除正常组外其余3组实验动物测量体质量，麻醉，固定，眼睑及其周围以碘伏棉签消毒3次、铺巾，将上下眼睑用4-0尼龙线褥式缝合固定于眶周皮肤上，摘除第3眼睑，生理盐水冲洗结膜囊。待成功苏醒后放回笼中。暴露6 h后将兔从笼中取出，拆除缝线，完成造模。

1.4 干预方法

由成都中医药大学药剂科提供清润养目口服液成品，根据动物与人体的体质量剂量折算系数表，计算高剂量组每天予2.3 ml/kg的清润养目口服液灌胃，低剂量组每天予0.575 ml/kg的清润养目口服液灌胃，剩余以生理盐水补足，模型组每天以等量生理盐水灌胃，正常组不予任何处理。每天均于16:00—18:00灌胃1次，连续灌胃4周。每2周测量体质量1次，根据体质量调整给药量。

1.5 检测指标

1.5.1 干眼检查：各组动物分别于造模前，造模后即刻、2周、4周行角膜荧光素染色（CFS）、泪液破裂时间（BUT）、Schirmer I试验（SIT）检查，每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同，并均由同一个人完成。角膜荧光素染色：一人固定实验兔，一人将荧光素钠溶液滴入兔眼结膜囊内，瞬目后，在裂隙灯钴蓝光下观察，观察角膜上皮完整性。评分方法：经角膜中心做水平与垂直两条线，将角膜划分为4个区，每个区按0～3分评分，总共12分。0分：无染色；1分：染色在10个点以下；2分：染色在10个点以上30个点以下；3分，染色在30个点以上或呈片状。泪膜破裂时间：结膜囊滴入荧光素溶液同前，一人固定实验兔同时双手撑开眼睑，一人在裂隙灯钴蓝光下用宽裂隙光带观察，记录从最后一次瞬目至角膜出现第一个黑斑即干燥斑的时间。SchirmerⅠ试验：将泪液检测滤纸条前端5 mm反折成直角，夹在实验兔下睑外侧结膜囊内，另一端悬挂在下睑外部，检测5 min后取出滤纸条，2 min后观察并记录滤纸条的湿长。

1.5.2 标本采集及病理分析：（1）取材及固定：造模给药4周后，以空气栓塞法处死实验兔，在手术显微镜下分别取角巩膜缘上方2 mm处、下方穹窿部大小约3 mm×3 mm结膜组织，并完整取下带1 mm巩膜环的角膜，放入FAA液中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸腊、包埋，切片，烘干备用。（2）HE染色。（3）分析：①穹窿部结膜：结膜组织分上皮和固有层两部分读取数据，分别于200倍物镜显微镜下观察记录炎性细胞数量，每组实验兔结膜组织（穹窿部和球结膜部）均进行该项检查，每个部位制作1张切片，每张结膜切片选取炎性细胞数量最多的3个视

野，用Mias-2000型图形图像分析仪测量炎性细胞面积、积分光密度、平均灰度，以积分光密度作为测量值，求取每张切片3个视野的总和作为该切片的测量值。②球结膜：因球结膜组织内炎性细胞较穹窿部明显减少，无法满足3个视野要求，故改用分级的方法，即按照标准判定每只实验兔球结膜的炎性细胞浸润程度，并记录。上皮及间质炎症程度按以下标准分级：（-）：无炎性细胞浸润；（+）：灶性炎性细胞浸润；（++）：多灶性炎性细胞浸润；（+++）：片状炎性细胞浸润。详见图1。

1.6 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析。符合正态分布的计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；组内的前后比较采用配对样本t检验。对不符合正态分布的计量资料，多组间比较采用Kruskal-wailis H检验。等级资料多样本比较采用Kruskal-wailis H检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物情况

实验过程中有2只实验兔因其他原因死亡，正常组、高剂量组各3只（6只眼）完成实验，模型组、低剂量组各4只（8只眼）完成实验。

2.2 CFS、BUT、SIT各时间段变化

造模前，四组实验兔CFS、BUT、SIT比较均无明显差异，且均在正常范围内，表明四组实验兔具有组间可比性；造模后即刻，造模兔上述三种指标比较亦无明显差异（P＞0.05），且均符合干眼诊断，表明模型成功，且干眼程度基本相同。造模后2周，高、低剂量组、模型组CFS、BUT、SIT较造模后即刻均有不同程度的改善（P＜0.05），高、低剂量组好于模型组（P＜0.05）。造模后4周，高、低剂量组上述三项指标较造模后2周进一步改善（P＜0.05），并好于模型组（P＜0.05），其中BUT、SIT结果与同期正常组接近（P＞0.05），高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组造模后2周时的指标改善考虑为拆除眼睑缝线后实验兔自身恢复的结果，造模后4周三项指标未见明显变化，提示干眼模型兔的眼表情况已趋于稳定（表1～表3）。

2.3 病理组织学观察

2.3.1 穹窿部：除正常组外，其余三组实验兔穹窿部结膜炎症程度相当（P＞0.05）（表4）。推测由于造模时穹窿部未长久暴露，对穹窿部炎性细胞的表达影响较小，故用药组与模型组穹窿部炎症情况无明显差异。

图1 实验兔结膜组织学检查分级（HE染色）A.（-）无明显炎性细胞浸润；B.（+）灶性炎性细胞浸润（如黑箭所指，下同）；C.（++）多灶性炎性细胞浸润；D.（+++）片状炎性细胞浸润

表1 各组实验兔不同时间CFS评分比较（±s）

注：组内比较（配对t检验），①与造模前比较P＜0.05，②与造模后即刻比较P＜0.05，③与造模后2周比较P＜0.05。组间比较（单因素方差分析，两两比较采用LSD法），a与正常组比较P＜0.05，b与模型组比较P＜0.05CFS：角膜荧光素染色

组别眼数（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常组60.00±0.000.00±0.000.67±0.530.67±0.53模型组80.00±0.008.23±0.96①a6.62±0.87①②a6.25±0.71①②a高剂量组60.00±0.008.13±1.06①a4.93±0.70①②ab1.29±0.49①②③ab低剂量组80.00±0.008.26±1.08①a5.33±0.65①②ab1.40±0.52①②③abF值0.000125.77186.025150.247 P值1.000＜0.001＜0.001＜0.001

2.3.2 球结膜部：正常组，球结膜复层柱状上皮结构清楚，细胞排列整齐有序，其间夹杂着数量较多的杯状细胞，杯状细胞内可见黏液形成，上皮细胞未见变性、坏死、凋亡及炎性细胞浸润，间质中血管未见扩张、充血，结缔组织中未见水肿、变性、坏死及炎性细胞浸润；模型组，上皮细胞内可见变性、坏死及炎性

细胞浸润，炎性细胞浸润以慢性炎性细胞为主，也可见少许急性炎性细胞，上皮细胞另可见凋亡，间质内血管扩张、充血及炎性细胞浸润，炎性细胞浸润以慢性炎性细胞为主，也有急性炎性细胞存在，未见明显水肿。高、低剂量组镜下表现基本相似，炎性细胞浸润差异无统计学意义（P＞0.05），上述改变较模型组有不同程度减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）（表5）。图2所示为各组实验兔球结膜部炎性细胞的表达情况。

表2 各组实验兔不同时间BUT比较（±s，s）

注：组内比较（配对t检验），①与造模前比较P＜0.05，②与造模后即刻比较P＜0.05，③与造模后2周比较P＜0.05。组间比较（单因素方差分析，两两比较采用LSD法），a与正常组比较P＜0.05，b与模型组比较P＜0.05BUT：泪膜破裂时间

组别眼数（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常组619.17±1.7218.00±1.6716.17±1.7217.83±1.33模型组819.00±2.677.07±1.45①a9.50±1.31①②a9.13±0.83①②a高剂量组619.33±2.507.23±1.28①a13.5±1.97①②ab17.50±2.25①②③b低剂量组819.13±2.237.42±1.40①a11.75±2.60①②ab15.88±2.23①②③bF值0.02386.40113.95739.588 P值0.995＜0.001＜0.001＜0.001

表3 各组实验兔不同时间SIT比较±s，mm）

注：组内比较（配对t检验），①与造模前比较P＜0.05，②与造模后即刻比较P＜0.05，③与造模后2周比较P＜0.05。组间比较（单因素方差分析，两两比较采用LSD法），a与正常组比较P＜0.05，b与模型组比较P＜0.05SIT：Schirmer I试验

组别眼数（只）造模前造模后即刻造模后2周造模后4周正常组6 1 9 . 3 3 ± 2 . 8 8 1 9 . 0 0 ± 2 . 1 0 2 1 . 3 5 ± 3 . 3 2b2 0 . 8 3 ± 3 . 4 5b模型组8 2 0 . 0 0 ± 3 . 0 2 5 . 5 9 ± 0 . 7 6①a1 2 . 4 6 ± 2 . 0 3①②a1 2 . 1 7 ± 1 . 4 3①②a高剂量组6 2 1 . 5 0 ± 5 . 3 1 5 . 7 6 ± 0 . 7 8①a1 6 . 7 3 ± 2 . 0 4①②ab1 8 . 5 5 ± 2 . 6 0①②③b低剂量组8 2 3 . 3 8 ± 5 . 1 8 5 . 7 1 ± 0 . 7 3①a1 5 . 3 3 ± 2 . 2 5①②ab2 0 . 0 7 ± 5 . 1 8①②③bF值1 . 3 0 8 2 0 3 . 6 2 5 1 5 . 8 9 1 9 . 5 4 8 P值0 . 2 9 5＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1

表4 各组实验兔球穹窿部结膜内炎性细胞浸润情况比较±s）（以积分光密度总和表示）

注：组间比较采用单因素方差分析

组别眼数（只）上皮间质模型组819550.20±14876.2442653.87±28292.12高剂量组626456.88±17530.2937797.23±29226.70低剂量组820018.28±15670.7637698.93±23152.39 F值0.7460.213 P值0.5350.887

表5 各组实验兔球结膜部结膜炎性细胞浸润情况比较（单位：标本数，包括上皮标本、间质标本）

图2 各组实验兔球结膜组织学检查（HE染色）A.正常组结膜无明显炎性细胞浸润B.模型组可见大量炎性细胞浸润C.高剂量组D.低剂量组亦可见炎性细胞浸润，但程度较模型组明显减轻

3 讨论

清润养目口服液所选处方于2007年9月始用于临床。处方组成：制黄精、北沙参、枸杞子、菊花。功效：养阴润目、清热祛风。方中制黄精、枸杞子为君药，具有补益肝肾、滋养肾阴之功效，臣以北沙参，养阴生津，更助君药养阴之力，佐以菊花清热祛风明目，载药上承，使邪气外达，亦可防止补益药物过于滋腻。四药相辅相成，药少但功强，共奏养阴润目，清热祛风之功效，使肝肾之阴得以濡养，热邪得清，津液运化输布正常，目珠得养，故眼干涩、白睛红赤、碜涩不适等症得以缓解。前期的临床观察表明〔2〕：清润养目方（免煎剂）联合玻璃酸钠滴眼液可以明显改善干眼患者的自觉眼部症状及全身症状，在总体提高干眼生活质量方面优于单纯予以玻璃酸钠滴眼液治疗的对照组。

2007年，国际干眼工作组将眼表炎症反应列入了干眼发病因素之中〔3〕，随之炎症理论引起了临床的广泛重视，抗炎治疗也发挥了一定的作用。目前大量的研究表明，很多中药均具有良好的抗炎作用，且毒副作用小，资源丰富。清润养目口服液是基于中医理论，结合多年临床实践，通过不断优化，筛选出的组方。药理学研究发现清润养目口服液药物组成中，黄精多糖是黄精的有效成分，孙化萍等〔4〕研究表明，含黄精多糖成分的滴眼液有抗炎、抗渗出、抗增生的作用，治疗干眼效果确切。薛春苗等〔5〕发现黄精多糖有明显的滋阴作用。枸杞子〔6〕中的有效成分胡萝卜素可在人体内转变为维生素A，能促进视网膜内视紫质的合成或再生，维持正常视力。刘咏梅等〔7〕研究表明北沙参粗多糖（GLP）具有滋阴补虚作用，同时可增强体液免疫和细胞免疫功能。国外学者〔8〕经研究发现从菊花中分离得到的三萜烯二醇、三醇及其相应的棕榈酸酯和肉豆蔻酸酯对由佛波酯（TPA）诱发的小鼠耳水肿具有明显的抗炎作用。以上现代药理学研究均已证实黄精、北沙参和菊花的抗炎作用。结合本实验病理学观察显示，用药28 d后，模型组实验兔球结膜炎症程度最重，高、低剂量组实验兔球结膜炎症程度较模型组明显减轻，提示清润养目口服液在减轻炎症反应方面有一定疗效。另外，本实验结果中，用药28 d后，高、低剂量组角膜荧光素染色明显减少、泪膜破裂时间及泪液分泌量均明显增加，即泪膜功能得到了一定程度的恢复，表明清润养目口服液在重建眼表方面有一定疗效。由此推测该口服液治疗干眼的作用与减轻局部炎症有关。

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The effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model

ZHENG Yanlin，YAO Man，PENG Xiaoli，et al.The Ophthalmology of Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China

OBJECTIVE To discuss the effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model.METHODS The 16 big-eared Japanese rabbit was randomly divided into 4 groups as normal group，model group，high dose group and low dose group.The normal group received non treatment but adaptive breeding，rabbits in the other three groups the model of dry eye by the method of suturing their eyelids to the skin and the partial removel of the third eyelid.CFS，BUT and SIT were examinated by the time point of befor modeling，immediately after modeling，2 weeks after modeling and 4 weeks after modeling.After given corresponding medicine for 28 days，killed the rabbits and taken out the eyes.The effect of Qingrun Yangmu oral liquid on the expression of conjunctiva inflammatory cells of dry eye rabbit model was observed by the HE stain.RESULTS（1）CFS，BUT，SIT：2 weeks after modeling compared with indexes of modeling accomplished，the CFS of model group，high dose group and low dose group were reduced，the BUT and SIT were prolonged.The differences of both the high dose group and low dose group were highly significant（P＜0.05）.Four weeks after-modeling，the three indicators of high dose group and low dose group were highly significant different compared with the instant figure after modeling and 2 weeks after-modeling（P＜0.05），but the model group had no significant change compared with 2 weeks after-model-

dry eye；Qingrun Yangmu oral liquid

R285.5

1002-4379（2016）01-0001-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.01.001

清润养目口服液工艺质量标准及药理学研究（四川省中医药管理局，2012-G-031）

1成都中医药大学附属医院眼科，成都610075

2成都市中西医结合医院眼科，成都610041

3成都中医药大学，成都610072

4成都中医药大学附属医院病理科，成都610075

姚曼，E-mail：manmanyao073@qq.com

ing（P＞0.05）.（2）The examination of the pathological histology：The control group，conjunctival tissue showed no significant inflammatory cell infiltration，but it had different levels of expression in the other three groups，the expression of inflammatory cell of fornix was stronger than the bulbar conjunctiva department.The expression of conjunctiva inflammatory cells in model group was stronger than that of the high dose group and the low dose group（P＜0.05）.CONCLUSIONS The Qingrun Yangmu oral liquid could reduce the inflammation reaction of dry eye rabbit model and it may be associated with the effect on the treatment.