黑麦草根系分泌物对根际微生物降解有机氯农药的效应

潘声旺，刘 灿，黄方玉

(成都大学城乡建设学院,四川，成都 610106)



黑麦草根系分泌物对根际微生物降解有机氯农药的效应

潘声旺，刘 灿*，黄方玉

(成都大学城乡建设学院,四川，成都 610106)

通过盆栽模拟试验，研究黑麦草Loliummultiforum的根系分泌物对根际微生物降解有机氯农药(Organochlorine pesticides，OCPs)的影响效应。结果显示，在供试OCPs含量(0～343.61 mg·kg-1)范围内，根系分泌物介导下植物-土壤-微生物系统(TR2)对OCPs污染物的去除具有明显的促进作用：3个处理中，TR2对OCPs的去除率最高(77.57%)，较对照组(CK)高出33.49%，较土壤微生物活性被抑制的植物-土壤系统(TR1)高出58.16%。借助细菌计数法对根际微生物数量的检测结果则显示，相同污染水平下，TR2系统里微生物数量最多，CK次之，TR1最少。说明黑麦草的根系分泌物对OCPs去除效果的促进作用可能与根际微生物种群数量的变化有关：根系分泌物的存在提高了根际微生物的种群数量，其降解效能随之提高。

有机氯农药；黑麦草；根系分泌物；根际微生物

有机氯农药(Organochlorine pesticides, OCPs)是一类高残留、生物富集性强的农药，性质稳定、水溶性差，极易吸附在土壤中，并通过食物链对生态环境和人体健康产生危害[1-3]。我国虽从1983年开始禁止使用OCPs，但目前仍可在多数土壤中检出[4-6]。随着全球范围内对环境保护和食品安全的日益重视，如何去除环境中OCPs残留已成为环境科学的研究热点。降解有机氯的方法有很多种，如化学法、物理法和植物修复。其中，植物修复技术因操作简便、环境友好、修复效果明显[7]，已成为治理残留农药的重要途径。本研究拟以成都平原主要蔬菜地土壤中OCPs的污染状况[7]为参照，以研究较多的黑麦草Loliummultiforum为试验材料，系统研究OCPs复合污染状态[8]下黑麦草的根系分泌物对根际微生物降解的影响效应、探讨其影响机制，为植物修复OCPs技术提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤：供试土壤为中性紫色土，采自成都大学十陵校区旱地表层，取样深度为5～15 cm。新鲜土样去除石子和植物残体，分为两部分，部分直接过9 mm筛后混合均匀，供盆栽培养植物用；部分风干后研磨过2.5 mm筛，用于土壤基本性质测定。经检测，理化性质如下：pH 7.19，有机质含量2.14×104mg·kg-1，阳离子交换量20.43 cmol·kg-1，速效N、P、K分别为31.62、24.74、94.81 mg·kg-1；砂粒、粉粒和黏粒的比例分别为71.27%、9.59%和19.14%。土壤风干后过2 mm筛，备用。

植物：选取修复效果较好的黑麦草为供试草坪其周边地区，选择大小相当植株，用3% H2O2消毒、蒸馏水清洗其根部后作移栽使用。

主要仪器： 气相色谱仪(Agilent6890)-Ni63，电子捕获检测器(GC-μECD)，Agilent7683系列自动进样器；数控超声波清洗器(KH-250DB)、电热恒温培养箱(DHP-9080B)、低速离心机、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9426)、针筒式过滤器(0.22 mm)、万用电炉、酸度计(PHS-3C)、层析柱、分析用研磨机(A11BS25)、高压蒸气灭菌锅等。

试剂：OCPs混标：HCHs (α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH)、DDTs (p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDE、p,p′-DDD)、六氯苯(HCB)、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、α-氯丹、γ-氯丹、硫丹I、硫丹II、硫丹硫酸盐、异狄氏剂醛、异狄氏剂酮、七氯、环氧七氯、甲氧滴滴滴,购自Supelco公司；无水硫酸钠、丙酮、正己烷等为分析纯，购自成都市科农化工试剂厂。

1.2 OCPs检测方法

土样前处理参照GB/T14550-1993的方法。

GC-ECD分析[9]：DM-5层析柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm),程序升温:初温90℃(1 min)；40℃·min-1升至170℃，23℃·min-1升至230℃保持17 min；40℃·min-1升至280℃保留5 min。进样温度260℃，检测温度300℃；氮气流速：1 mL·min-1；尾吹：60 mL·min-1；不分流进样，进样量1 μL。

GC/MS-MS分析：岛津气相色谱(GC2010),离子阱质谱，色谱-质谱接口温度250℃，离子源温度230℃；离子化方式: EI；电子能量：70 eV；溶剂延迟：6 min；全扫描范围：40～500 AMU。

按照此方法，OCPs回收率为90%～120%，检出限为0.07～0.15 μg·kg-1。

1.3 试验设计

1.3.1 收集根系分泌物 采用土培法进行黑麦草根系培养，待培养30 d后，选择长势一致的植株转入烧杯中培养。移苗后的植株先用蒸馏水缓苗2 d，然后更换为Hogland营养液，培养3 d，期间每天补充营养液维持液面高度。之后将营养液更换为含定量OCPs (66.67 mg·L-1)的半量Hogland营养液，进行OCPs胁迫处理，5 d后，黑麦草由胁迫液中移出，洗净根表面，再顺次用0.2 mmol·L-1CaSO4和30 mg·L-1氯霉素溶液浸泡2 h和30 min，蒸馏水洗净3遍后，浸于盛有适量Milli-Q超纯水的烧杯中(锡纸包裹杯壁，确保根部避光；液面高度以漫过根部为宜)中收集根系分泌物，每2 h更换1次收集液，连续收集4次。合并收集液，过0.45 μm的滤膜，对收集液进行真空旋转蒸发浓缩(40℃)，浓缩约4倍后，获得总有机碳TOC为246 mg·L-1的根系分泌物浓缩液，于-20℃保存[10-11]。

1.3.2 配置OCPs污染土样 以成都市区蔬菜地土壤中实际OCPs复合污染状态[8]为参照，依照一定浓度比例，分别称取一定量的∑DDT、∑HCH、HCB、艾氏剂、狄氏剂、毒杀芬、灭蚁灵、硫丹Ⅰ、环氧七氯、γ-氯丹等)溶于丙酮溶液中，均匀洒在土壤表层，待丙酮挥发后，多次搅拌，混匀，遮光封口、加盖，室温下平衡7 d。GC/MS-MS法测定土壤中OCPs初始浓度为343.61 mg·kg-1(C5)，其中，∑DDT、∑HCH、HCB、艾氏剂、狄氏剂、狄氏剂、毒杀芬、灭蚁灵、硫丹Ⅰ、环氧七氯、γ-氯丹的含量分别为299.52、14.49、8.13、1.05、1.89、3.21、1.98、1.65、3.42和8.27 mg·kg-1。以此(C5)为基础，分别用一定量未污染土对C5土样进行稀释，搅拌混匀，遮光条件下室温内下平衡7 d后，测得其含量分别为：66.67 mg·kg-1(C1)、138.47 mg·kg-1(C2)、205.14 mg·kg-1(C3)、282.07 mg·kg-1(C4)。

1.3.3 模拟修复试验 3个处理、5个重复，①处理1(对照，CK)：OCPs污染土样；②处理2(TR1)：加入0.05% NaN3(抑制微生物活性)的OCPs污染土样；③处理3(TR2)：加入黑麦草根系分泌物的OCPs污染土样。温室平衡7 d后，检测各处理中OCPs残留量。

1.3.4 细菌培养与计数 精确称量牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g配制溶液，用10 mol·L-1NaOH将pH调至7左右。热溶后，将培养基分装于5个三角锥形瓶中、加塞，0.103 MPa、120℃条件下高压蒸汽灭20 Min菌[12]。将灭菌后的培养基在没有凝固之前倒入同样灭菌的平板(共288套)中；混菌法[13]分别对不同处理各个污染水平的根际土壤悬液接种，共15组，另设无OCPs污染土样做对照(C0)，并按照一定浓度梯度(取0、10、20、30、40、50 mL根系分泌物浓缩液定容至50 mL)分别向TR2处理的16组平板中加入2 mL根系分泌物浓缩液，各设置3个重复。20℃、无菌条件下恒温培养7 d后，计算各自菌落数。

1.4 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据处理、SPSS 13.0软件LSD法分析不同处理间差异显著性。其中，OCPs降解率(R)计算式为：R=[(C0-Ct)/C0]×100% ；C0代表土壤中OCPs初始浓度，Ct表示各处理下土壤中的残留浓度。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤中OCPs的降解差异

模拟修复试验于温室平衡7 d后，CK、TR1、TR2处理所在土壤中OCPs的降解率与初始浓度关系如图1所示。可以看出，随着OCPs的污染水平的增加，OCPs的残留量越高；相同污染水平下，土壤中OCPs的降解率表现为TR2> CK > TR1，差异显著(P<0.05)。

在去除效果上，土壤-根系分泌物系统(TR2)所在土壤中OCPs降解率平均为77.57%；微生物活性被抑制的土壤中(TR1)所在土壤中OCPs降解率平均为19.41%；土壤系统(CK)所在土壤OCPs降解率为44.08%，不同处理间差异显著(P<0.05)。因自然光解、挥发、吸附等因素对植物修复的贡献相对较小[14]，TR2处理中OCPs的高降解率可能与所添加的根系分泌物有关。

2.2 根系分泌物添加量对OCPs降解率的差异

图2为根系分泌物添加量对同一污染水平土壤中OCPS修复效果的影响。可以看出，根系分泌物的添加量不同，土壤系统降解率也不一样，总体上OCPs修复效果随根系分泌物添加量的增加而增强，添加量为30 mL(约合7.38 mg TOC)时增幅最大。

2.3 不同处理土壤中细菌数差异

图3为不同污染水平下不同处理中细菌总数差异。同一个污染水平下(图3-A)，TR2的细菌数最多，CK次之、TR1最少，三者差异显著(P< 0.05)。说明根系分泌物的存在使得土壤修复系统中细菌总数增加。相同处理条件下(图3-B)，除添加0.05%的NaN3(抑制微生物活性)的TR1处理外，土壤中细菌总数均随着OCPs污染水平的升高而增多，在C5水平时均明显高于无污染对照土壤(C0)，其原因可能与高浓度的污染物存在能够为细菌生长提供更多的可利用碳源有关。

2.4 不同根系分泌物添加量土壤中细菌数差异

图4为相同污染水平(C3)下TR2处理中不同根系分泌物添加量对细菌总数的影响。可以看出，根系分泌物添加量越多，根际土壤中细菌总数越多，说明根系分泌物的存在加快了细菌的生长代谢，使得细菌的种群数量增加。试验含量范围内，其他污染水平条件下，根系分泌物添加量对细菌总数的影响趋势与C3污染水平下相同。

3 讨论与结论

植物的存在能加快土壤中有机污染物的去除,根系分泌物营造的根际环境则是污染物快速消解的重要原因[15]。植物修复过程中，根系分泌物在改善土壤属性、提高污染物生物可利用性、缓解环境胁迫等方面具有重要作用。一方面，根系分泌的某些胞外酶能够直接参与污染物的降解过程；另一方面，分泌物中的可溶性糖、低分子量有机酸、氨基酸等物质，为根际微生物提供充足的营养,增加根际微生物的数量、提高微生物活性，进而加速污染物降解。同时,根系分泌物还会直接影响污染物的固定和活化，进而影响污染物在土壤-植物系统中的迁移转化行为、促进OCPs的去除[16]。本研究表明，黑麦草根系分泌物对OCPs降解有促进作用。降解平衡7 d后，根系分泌物介导下植物-土壤-微生物系统(TR2)中OCPs降解率为77.57%，去除效果明显大于CK、TR1。相同污染水平下，TR2中细菌总数明显大于CK，说明根系分泌物对细菌的生长代谢有促进作用；相同污染水平下，土壤中细菌总数随根系分泌物添加量的增加而增加，说明根系分泌物为细菌的生长代谢提供了营养条件，到达一定限值后，根系分泌物浓度对细菌总数的影响逐渐减小，这是因为土壤微生物对其自身的营养达到饱和。研究显示，根系分泌物促进了土壤中微生物的生长发育，进而使得土壤中OCPs降解率的增大。尽管土壤吸附、挥发、光解等过程也是土壤中OCPs的减少原因之一，但根系分泌物-微生物间的交互作用是修复土壤OCPs污染的主要途径。

本研究中，TR1中OCPs浓度的降低，主要是非生物(挥发、光解、土壤吸附等)作用的结果，但非生物因素的去除不是主要的原因，仅占19.41%。而CK中OCPs浓度的降低主要有两方面原因：第一，土壤中固有微生物分解即土壤微生物的降解作用，这部分作用贡献率可用TR1的平均去除率减去CK的平均去除率得到，土壤微生物降解作用为24.67%，可见，土壤微生物的去除也不是OCPs去除的主要原因；第二，非生物作用(挥发、光解、土壤吸附)的结果，这部分作用与TR1的去除率相同，为19.41%。对比分析CK与TR1可知，微生物作用为24.67%，非生物因素作用为19.41%，污染土壤中微生物降解OCPs效果高于非生物因素，CK处理土壤比TR1处理土壤多降解的OCPs为微生物作用的结果。TR2中OCPs去除，是土壤微生物分解、非生物作用(挥发、光解、土壤吸附等)、根系分泌物对根际微生物降解效能促进作用等因素共同作用的结果。其中，根系分泌物与微生物共同作用为77.57%，根系分泌物促进微生物降解为33.49%。对比分析不同处理中OCPs残留量可知，黑麦草根系分泌物的存在对土壤中OCPs降解具有促进作用。

相同污染水平下，土壤中细菌总数随根系分泌物添加量的增加而增加，到一定限值后增加趋势减小，其主要原因是根系分泌物的存在为微生物的生长提供了能量，加快了微生物生长代谢的速度，土壤中微生物数量迅速增加，其降解率也就相应增加。可见，在整个过程中，根系分泌物起到了增加微生物的数量和提高微生物降解效能的作用，同时土壤中的根系分泌物含量到达一定值后，即超过了微生物所需的能量，则根系分泌物对微生物的影响也减小。也就是说，根系分泌物到达一定的范围后，微生物生长代谢所需营养达到饱和，所以根系分泌物添加量对细菌数目的影响减小。

植物修复过程中，根系分泌物对根际微生物的降解效能具有促进作用。在7 d的修复平衡试验中，约有77.57%的OCPs被降解, 但非生物因子作用仅占土壤中OCPs总量的19.41%，微生物作用占44.08%，根系分泌物-微生物协同作用比微生物单独作用OCPs的残留量低33.49%。

根系分泌物的存在为微生物生长代谢提供营养和能量物质、代谢活性加快，微生物种群数量增多，进而强化了根际微生物的降解效能、提高了土壤中OCPs降解率。

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(责任编辑：林海清)

Effect of Exudates from Ryegrass Roots on Organochlorine Degradation by Rhizospheric Microbes

PAN Sheng-wang，LIU Can*，HUANG Fang-yu

(FacultyofUrbanandRuralConstruction,ChengduUniversity，Chengdu，Sichuan610106,China)

Pot experiments were conducted to investigate effect of the exudates from roots of ryegrass (Loliummultiforum) on microbial degradation of organochlorine pesticide(OCP) residues in rhizospheric soil. The results showed that,within the tested concentrations of 0-343.61 mg·kg-1, the exudates exhibited a significant enhancement on OCPs degradation in the soil. And, the highest OCPs removal rate at 77.57% was achieved when the root exudates were added in the presence of rhizospheric microbes; whereas, without the exudates,the removal rate was merely 33.49%, and it was 58.16% in the soil spiked with 0.05% NaN3to suppress the microbial effect.Furthermore, under a same level of the pesticide stress, the microflora population increased with increasing exudates concentration in the soil suggesting that phytoremediation of the ryegrass under stress might also encourage the growth and metabolism of the rhizospheric microbes leading to the improved OCPs degradation.

organochlorine pesticides; ryegrass; root exudate; rhizosphere microbes

2016-04-13初稿； 2016-06-03修改稿

潘声旺(1973-)，男，博士，副教授，主要从事环境生态、污染生态研究(E-mail: panwang@swu.edu.cn)

国家级大学生创新创业实验项目(201511079008)；四川省大学生创新创业训练计划项目(201411079026、 201511079008)

X 131.3

A

1008-0384(2016)08-876-05

潘声旺，刘灿，黄方玉.黑麦草根系分泌物对根际微生物降解有机氯农药的效应[J].福建农业学报，2016，31(8)：876-880.

PAN S-W，LIU C，HUANG F-Y.Effect of Exudates from Ryegrass Roots on Organochlorine Degradation by Rhizospheric Microbes[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：876-880.

*为通讯作者