食管鳞癌组织中miR-199a的表达变化及临床意义

齐海亮，宋鑫亮，齐科雷，李明珠，杜秀然，苏宏伟，王鹏

(河北省胸科医院，石家庄050041)



食管鳞癌组织中miR-199a的表达变化及临床意义

齐海亮，宋鑫亮，齐科雷，李明珠，杜秀然，苏宏伟，王鹏

(河北省胸科医院，石家庄050041)

目的 观察miRNA-199a在食管鳞癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。方法 选取食管鳞癌患者56例，术中取食管鳞癌组织及癌旁正常组织。采用SYBR Green qRT-PCR技术检测食管鳞癌、癌旁正常组织中的miRNA-199a，并分析食管鳞癌组织中miRNA-199a表达与患者临床病理参数的关系。结果 食管鳞癌组织中miR-199a相对表达量为0.056±0.006，癌旁正常组织为0.082±0.004；两者比较，P<0.01。食管鳞癌患者肿瘤分化程度低、TNM分期高及存在淋巴结转移者，癌组织miR-199a相对表达量减少(P均<0.05)；不同年龄、性别的食管鳞癌患者，癌组织miR-199a相对表达量无统计学差异(P均>0.05)。结论 miR-199a在食管鳞癌组织中表达下调，且与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，可能作为抑癌基因参与食管鳞癌的发生、发展。

食管鳞癌；微小核糖核酸-199a；肿瘤分化；TNM分期；淋巴结转移

微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，能通过核酸序列的互补性结合到特定的靶mRNA上，并通过调节、翻译或降解靶mRNA来调控基因表达，参与细胞的分化、增殖、凋亡等[1，2]。研究发现，miRNA还可作为癌基因或抑癌基因，调控肿瘤的发生、发展和转移[3]。miR-199a作为miRNA家族成员之一，其表达变化与肺癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌等多种肿瘤密切相关，但目前其在食管鳞癌组织中的表达变化鲜见报道。2014年9月～2015年6月，我们观察了食管鳞癌组织中miRNA-199a的表达变化，并分析其与患者临床病理参数的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取同期河北省胸科医院实施手术切除的食管鳞癌患者56例，男36例，女20例；年龄39～77岁，中位年龄60岁；组织分化程度：高中分化23例，低分化33例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期16例；无淋巴结转移32例，有淋巴结转移24例；所有患者术前未行放疗、化疗及生物治疗。术中取食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)，并且术后均经组织病理学检查明确诊断。

1.2 miR-199a检测方法 取食管鳞癌组织及癌旁正常组织标本，以TRIzol法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度、纯度和完整性。经检测所提取的总RNA无降解，标本合格，可用于后续实验。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。反应体系20 μL，其中总RNA 1.5 μL、特异性茎环反转录引物2 μL、RNA酶抑制剂1 μL、缓冲液4 μL、逆转录酶1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、DECP水8.5 μL。反应条件：42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。逆转录反应后产物cDNA，-20 ℃保存备用。使用Primer Premier5.0软件设计miR-199a和内参基因U6的引物序列，由中国北京赛百盛基因技术有限公司合成。引物序列：miR-199a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照TaqMan PCR试剂盒说明进行PCR反应。PCR反应体系20 μL，其中cDNA模板2 μL、上下游引物各0.6 μL、2×Taqman Universal Pcrmaster Mix 10.0 μL、DECP水6.8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸7 min。每个样本做3个复孔。记录每个荧光反应管中的荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值，将原始数据取3次重复的平均值；以U6为内参，进行归一化，使用定量PCR中的相对定量法，得出ΔCt。ΔCt=CtmiR-199a-CtU6，以2-ΔΔCt法计算miR-199a在组织中的相对表达量。

2 结果

2.1 食管鳞癌组织、癌旁正常组织中miR-199a表达比较 食管鳞癌组织中miR-199a相对表达量为0.056±0.006，癌旁正常组织为0.082±0.004。食管鳞癌组织中miR-199a的相对表达量明显低于癌旁正常组织(t=-36.222，P<0.01)。

2.2 食管鳞癌组织中miR-199a表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 食管鳞癌组织中miR-199a表达与患者 临床病理特征的关系±s)

3 讨论

miRNA是一类非编码小分子RNA，其主要功能是参与并调控基因表达，通过识别靶基因mRNA的3′端非翻译区，抑制靶基因表达[4]。自从首个miRNA功能被确认以来，miRNA已成为生命科学研究领域的热点之一。目前，已知的miRNA几乎参与了所有的生物学过程，维系着生物正常基因表达和生理功能。如果miRNA表达出现异常，则可导致疾病的发生。近年研究发现，很多miRNA通过调控肿瘤细胞的增殖、分化、迁移等生物过程，参与肿瘤的发生、发展过程[5～8]。

miR-199a是位于人发动蛋白2基因的16号内含子，在许多疾病的病理生理过程中发挥重要的调控作用。Xu等[9]研究发现，缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织中miR-199a表达下调。Rane等[10]通过荧光素酶报告基因实验证实HIF-1α是miR-199a的靶基因，miR-199a在缺血缺氧时通过上调HIF-1α发挥脑保护作用。在肿瘤方面，miR-199a发挥着双向调控作用。研究发现，在肺癌中miR-199a负性调控原癌基因Met，随后证实在前列腺癌中同样存在这种负性调控。Hou等[11]报道，miR-199a能通过抑制肿瘤促进因子PAK4的表达，从而阻断PAK4/Raf/MEK/ERK信号通路，进而抑制肝癌细胞的增殖。同样存在这种负性调控的肿瘤，还有骨肉瘤、卵巢癌、膀胱癌等。然而，Song等[12]报道，在胃癌组织中miR-199a表达明显上调。Lee等[13]发现，在宫颈癌组织中miR-199a表达显著上调，并把反义miR-199a寡核苷酸转染入宫颈癌细胞后，阻断miR-199a的表达，则明显抑制癌细胞的生长。但是Pereira等[14]研究中选择U6作为内参，结果提示miR-199a在宫颈癌组织中表达显著下调。根据以上研究结果我们分析，miR-199a在肿瘤组织或细胞的表达与调控作用或许受多种因素影响。

本研究结果发现，食管鳞癌组织中miR-199a相对表达量明显低于其相应的癌旁组织，而且通过结合患者的临床病理资料发现，miR-199a的表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，表现为组织分化程度越低、TNM分期越晚、出现淋巴结转移，miR-199a表达降低更明显，而与患者年龄、性别无明显关联。因此认为，miR-199a在食管鳞癌组织中表达下调，可能引起某种促癌机制活化，导致食管鳞癌发生、发展、侵袭和转移。但是，其发生机制尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，miR-199a在食管鳞癌组织中表达下调，随着肿瘤的侵袭及转移其表达进一步下调，可能作为抑癌基因参与食管鳞癌的发生、发展。

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河北省科技支撑计划项目(132777221)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.015

R735.1

B

1002-266X(2016)38-0045-03

2016-05-07)