HPLC测定不同产地防风中4种有效成分的含量

胡紫艳冯振斌蒋健

（1南京市食品药品监督检验院，江苏 南京210000；2吉林省药品检验所，吉林 长春130033）

HPLC测定不同产地防风中4种有效成分的含量

胡紫艳1冯振斌2蒋健1

（1南京市食品药品监督检验院，江苏 南京210000；2吉林省药品检验所，吉林 长春130033）

目的：建立防风中4种有效成分的含量测定方法，并比较不同产地防风4种成分的含量。 方法：色谱柱：Agilent HC C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；甲醇-水（45∶55）为流动相；检测波长为254 nm；柱温35℃。结果：升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮类成分的加样回收率均在95%～105%，其RSD均＜3%。结论：不同产地防风药材4种有效成分的含量差别较大；所建立的同时测定升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种有效成分的测定方法准确度、重复性好，专属性强，可有效评价不同产地防风药材的质量。

防风；产地；升麻素；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷；亥茅酚苷；高效液相色谱法

本品为伞形科植物防风〔Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.〕的干燥根。春、秋二季采挖未抽花茎植株的根，除去须根及泥沙，晒干[1]。防风按野生产区可分为口防风、关防风、西北防风；防风的栽培品为家防风，家防风是各地栽培品的统称[2]。由于防风品种复杂，性状鉴定困难，混淆品多，栽培用种不确切，导致药材质量参差不齐[3]。目前文献研究较多的是野生品和栽培品的质量差异[4-8]。历代本草对防风产地的记载主要包括陕西、黑龙江、山东、河南、江苏、浙江及湖北北部等地。现今，防风的主要产区为东北和内蒙古，质量也以东北的黑龙江为最佳。古今防风的产区变化很大，主要是防风的产地由南向北移，由关内移到了关外的东北和内蒙古地区[9]。肖永庆等[10]对不同产地的防风药材及饮片分析，发现不同产地的样品品质有很大差别。药理实验研究表明，防风具有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗过敏、抗惊厥、抑菌和增强机体非特异性免疫功能的作用[11-13]。前人研究表明，防风中所含有的色原酮类成分，是其发挥药效作用的主要物质基础，其中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥矛酚苷四种色原酮类均有降压作用。升麻素和亥矛酚苷还有消炎、止痛作用[14-17]。本文对河北、吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、山西、黑龙江、山东等不同产地的样品进行了 4种有效成分升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的同时测定，并比较各产地的含量差异，为防风药材的质量评价提供了科学依据。现报道如下。

1　仪器与试药

LC-2010CHT高效液相色谱仪；试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水；升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥矛酚苷对照品（批号：111522-200406，111523-200405，111710-200501，111714-200501，购自中国食品药品检定研究院）。

防风药材 10批（产地分别为：河北、吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、山西、黑龙江、山东），均为2年生秋季采挖植株。10批次供试品经南京市食品药品监督检验院药品所鉴定，均为防风的干燥根。

2　方法与结果

2.1色谱条件

固定相：Agilent HC C18色谱柱 （250 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇 ∶水（45∶55）；流速：1.0 m L/min；柱温：35℃；检测波长为 254 nm；理论板数按升麻素苷峰计算应不低于4 000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液取升麻素苷对照品、升麻素对照品、亥茅酚苷对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 m L含49，71，89，90μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液取本品细粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 m L，称定质量，水浴回流 2小时，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3干扰试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液及溶剂各5μL，按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1～ 3。结果表明其他成分测定无干扰。

图1　溶剂HPLC图

图2　对照品HPLC图

图3　供试品HPLC图

2.4标准曲线的绘制与线性关系考察

精密量取升麻素苷对照品溶液（0.490 mg/m L）1，2，5，10，20m L，升麻素对照品贮备液（0.712mg/m L）0.5，1，2，5，10 m L，亥茅酚苷对照品贮备液（0.893 mg/m L）0.5，1，2，5，10 m L，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品贮备液（0.901 g/m L）0.5，1，2，5，10 m L，分别置于50 m L容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μL注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件测定升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积。以浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得升麻素苷回归方程：

Y＝ 6.332 7X－3.163 2，

r＝ 0.999 9（n＝ 5），线性范围为9.80～196.00μg/L；

升麻素回归方程：

Y＝ 20.556X－ 0.752 3，

r＝ 1（n＝ 5），线性范围为7.12～142.40 μg/L；

亥茅酚苷回归方程：

Y＝8.132 4X－6.607，

r＝ 0.999 7（n＝ 5）线性范围为8.93～178.60μg/L；

5-O-甲基维斯阿米醇苷回归方程：

Y＝4.847 8X－1.999 4，

r＝ 0.999 9（n＝ 5），线性范围为9.05～181.00μg/L。

2.5精密度试验

取同一供试品溶液 （产地辽宁），连续进样6次，结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷峰面积的 RSD分别为 0.35%，0.45%，0.63%和0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

取同一供试品溶液（产地辽宁）5μL，分别在0，4，8，16，24 h，重复进样共 6次，测定峰面积。结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷峰面积的RSD分别为0.60%，0.71%，0.97%和1.02%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重现性试验

取同一供试品（产地辽宁）6份，依法独立测定。结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的平均含量分别为0.257%，0.151%，0.379%，0.045%，RSD分别为1.03%，0.80%，0.59%和0.66%，表明本法的重现性良好。

2.8回收率试验

精密称取已知含量（升麻素苷含量为2.602mg/g、升麻素为1.541 mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量为3.818 mg/g和亥茅酚苷含量为0.463 mg/g）的样品（产地辽宁）0.25 g，分别精密加入低、中、高3个加入量的混合对照品溶液 （每个加入量 3份），按“2.2.2”项下方法制备，照“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果

3　样品测定结果

取对照品溶液、供试品溶液适量，按上述色谱分析条件测定，测定10批样品，结果见表2。

4　讨论

4.1测定波长的选择

取本品细粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 m L，称定质量，水浴回流2小时，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取供试品溶液2μL，注入液相色谱仪，分别在254，270，280，300，320 nm进行测定，结果254 nm各色谱峰信号最强，给出信息最多，故选择254 nm作为测定波长。

4.2提取溶剂的选择

本试验考察了75%甲醇、乙醇和甲醇三种溶剂，结果特征峰差异不大，考虑到流动相为甲醇-水，故选择甲醇作溶剂。

4.3流动相的选择

参照《中国药典》（2010年版）一部“防风”含量测定项下的方法，以甲醇 ∶水（40∶60）为流动相，亥矛酚苷色谱峰保留时间太长，故将流动相比例调整为甲醇 ∶水（45∶55），对照品色谱峰保留时间适当，供试品色谱峰分离效果好。经等梯度洗脱，采集时间为100分钟，样品在 40分钟以后未出现其他特征峰。故采用甲醇 ∶水（45∶55）为本法的流动相。

表2　样品测定结果

5　总结

防风作为药用商品品种较多，来源复杂，近缘种作为习用品应用较多。本研究从生药主产地随机抽样，结果不同产地的防风药材及饮片中4种色原酮类成分含量差别很大，其中吉林、内蒙古东部、黑龙江、辽宁的药材中 4种有效成分的总含量明显高于其他产地；河北和甘肃均查出不合格样品。与邵留英等[18]对不同产地防风饮片中有效成分含量比较一文的测定结果一致，并以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷作为测定指标佐证了东北三省是防风的道地药材[19]。这可能与各地气候条件、土壤状况、纬度、海拔、高度、日照强度、栽培条件、采集季节以及药材的储存条件等因素不同有关，已有研究表明不同生长环境防风净光合速率、蒸腾速率及水分利用效率等均有变化[20]，具体原因还有待进一步探讨。由于不同来源产地药材4种色原酮含量存在差异，可为该药材品种及产地的鉴别提供一个思路，为市场上不同来源产地药材的使用提供一定的借鉴作用，同时也为防风中药材市场药材规范化管理、药品质量保障、药材鉴定等方面提供了参考依据。

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Determ ination of Four Components in Saposhnikovia Divaricata from Different Habitats by HPLC

Hu Ziyan1，Feng Zhenbin2，Jiang Jian1（1 Nanjing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Nanjing 210000，China；2 Jilin Institute for Drug Control，Jilin Changchun 130033）

Objective：To develop a HPLC method for simultaneous determ ination of 4 bioactive components in saposhnikovia divaricata，and to compare the content of the 4 components in S.divaricata from different habitats. M ethods：Agilent HC C18column(250 mm×4.6 mm，5μm)wad adopted，using the m ixture of methanol and water（45∶55）as amobile.Thewavelength for detection was setat254 nm，while the temperature of column at35℃. Results：The recovery rates of cimicifugin，Prim-o-glucosylcimifugin，4’-O-beta-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol and sec-O-glucosylhamaudol were 95% ～ 105%，w ith RSDs of less than 3%.Conclusion：The contents of four bioactive components in S.divaricata from variou habitats showed significant difference.However，the developed HPLC method for simultaneous determ ination of the four components showed high accuracy，reproducibility and specificity，which was effective in evaluation of quality of S.divaricata.

Saposhnikovia Divaricata； Habitats； Cimifugin； Prim-O-glucosylcimifugin； 4’-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamm inol；Sec-O-glucosylhamaudol；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.007

胡紫艳，女，硕士，主管药师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：huzy0903@163.com

（2016-06-29）