HPLC测定止痛壮骨散中川续断皂苷Ⅵ的含量

杜建红寇新民王艳丽涂显勤

（1成都军区联勤部药品仪器检验所，四川 成都610017；2成都军区八一骨科医院，610015）

HPLC测定止痛壮骨散中川续断皂苷Ⅵ的含量

杜建红1寇新民2王艳丽1涂显勤2

（1成都军区联勤部药品仪器检验所，四川 成都610017；2成都军区八一骨科医院，610015）

目的：建立高效液相色谱法测定止痛壮骨散中川续断皂苷Ⅵ的含量。方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶（250 mm×4.6 mm，5μm）为填充剂色谱柱，流动相：乙腈-水（30∶70），流速1.0 m L/m in，检测波长212 nm，柱温30℃，进样量10μL。结果：川续断皂苷Ⅵ浓度在10.22～ 204.44μg/m L（n=7）范围内线性关系良好（r＝0.999 3）；回收率在98.40%～ 101.16%之间，试验结果RSD为1.07%（n=9）。结论：该方法操作简便、准确、专属性好，可用于止痛壮骨散质量控制的方法。

止痛壮骨散；川续断皂苷Ⅵ；高效液相色谱法

止痛壮骨散为成都军区八一骨科医院研制的院内制剂，由杜仲、续断、桑寄生等9味中药材组成，方中杜仲甘温，补肝肾，强筋骨，“主腰脊痛，益精气，坚筋骨”，为治肾虚腰痛要药；续断增强杜仲补肝肾、强筋骨功效，对腰部劳损，能行血脉、续筋骨，故二者为本方君药。肾虚，寒湿之邪易犯，桑寄生苦温，配以“主治湿痹邪”之酸、可增强杜仲、续断补肾壮阳，且善逐寒湿，为臣药。本方具有活血化瘀，温经通络，壮腰固肾等功效，临床用于腰肌劳损，风湿痹痛，陈旧性软组织伤，久治不愈的各种筋骨痛。该药2000年获得制剂批准文号，分别于 2005年、2010年按要求换发批准文号，期间标准未作修订。根据止痛壮骨散中的处方组成，综合考虑，参照文献[1-2]建立高效液相色谱法（HPLC）测定君药续断中川续断皂苷Ⅵ含量的方法，以更好地控制本品的质量。

1　仪器与试药

岛津LC-20AB型液相色谱仪；电子分析天平（Sartorius CPA225D，感量0.1 mg）；川续断皂苷Ⅵ对照品（批号：111685-201304；含量：94.30%；来源于中国食品药品检定研究院）；止痛壮骨散（每袋装50 g，成都军区八一骨科医院，批号：20131129，20140224，20140416），乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为：乙腈-水（30∶70）；检测波长：212 nm；柱温：30℃；流速：1.0 m L/min；进样量：10μL.

2.2供试品制备方法考察

2.2.1提取方式考察取供试品（批号：20131129）约1.5 g，4份，精密称定，采用甲醇作为提取溶剂，分别采用超声（功率240W，频率40 kHz）、回流方法提取60分钟，取出放冷后，再用流动相稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液，分别测定供试品溶液中川续断皂苷Ⅵ的含量，试验结果见表1。由表1中测定结果可知，超声提取比回流提取所制备的供试品溶液中川续断皂苷Ⅵ含量略高，且超声提取方法简便易行。因此，选择超声（功率240W，频率40 kHz）提取作为止痛壮骨散中续断含量测定供试品溶液的提取方法。

表1　提取方式考察结果

2.2.2提取溶剂考察取供试品（批号：20131129）约1.5 g，精密称定，分别用50%甲醇、甲醇、流动相作为提取溶剂（平行制备两份），超声60分钟，取出，放冷，过滤，取续滤液用流动相稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液，分别测定供试品溶液中川续断皂苷Ⅵ的含量，试验结果见表2。结果显示，50%甲醇和甲醇的超声提取效果无明显差异，用流动相提取的含量略低于前两种溶剂的提取量且易堵塞滤头。拟采用甲醇作为本品含量测定的供试品提取溶剂。

表2　提取溶剂考察结果

2.2.3提取溶剂用量考察取供试品（批号：20131129）约 1.5 g，6份，精密称定，采用不同量的甲醇作为提取溶剂（平行制备两份），超声（功率240 W，频率40 kHz）提取60分钟，制备供试品溶液，分别测定供试品中川续断皂苷Ⅵ的含量，试验结果见表3。结果显示，对于称样量相同的供试品，采用25 m L和50 m L的甲醇提取，结果差异较小，暂定采用25 m L的溶剂进行超声提取。

表3　提取溶剂用量考察结果

2.2.4提取时间考察取供试品（批号：20131129）约1.5 g，精密称定，甲醇作为提取溶剂（平行制备两份），分别超声处理（功率240 W，频率40 kHz）10，20，30，45分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得，分别测定供试品溶液中川续断皂苷Ⅵ含量。试验结果见表4。

表4　提取时间考察结果

结果显示，超声提取10，20，30，45分钟，供试品溶液中的川续断皂苷Ⅵ含量无明显的差异，表明在此提取时间段内样品中的川续断皂苷Ⅵ基本提取完全，综合考虑，采用20 m in作为供试品溶液的提取时间。

2.3溶液的制备

①供试品溶液的制备取本品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 m L，密塞，称定质量，超声处理（功率240 W，频率40 kHz）60分钟，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 m L，置10 m L量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。②对照品溶液的制备取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成每1m L含0.18mg的溶液，摇匀，即得。③阴性对照溶液按处方比例及工艺制备缺续断的阴性对照样品，按供试品溶液项下方法制成阴性对照溶液。

2.4专属性考察

分别吸取供试品，按“2.1”项下的色谱条件，进样测定，记录色谱图。结果显示阴性对照溶液色谱峰对测定无干扰，专属性良好，见图1。

图1　止痛壮骨散的HPLC图谱

2.5线性关系考察

精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，制备对照品储备液，再用流动相稀释成一系列的线性对照品溶液。按照拟定的测定条件进行测定，记录峰面积。以川续断皂苷Ⅵ浓度X（μg/m L）为横坐标，数据分别为10.22，20.44，51.11，102.22，122.67，153.33，204.44，川续断皂苷Ⅵ峰面积Y为纵坐标，数据分别为19 415，39 488，100 277，227 266，259 789，326 449，452 892，进行回归，回归方程为：

Y=2 221.4X-7 155.9，

试验结果显示，川续断皂苷Ⅵ浓度在10.22～204.44μg/m L范围内线性关系良好（r＝0.999 3）。

2.6精密度试验

取同一对照品溶液（每1 m L含0.18 mg的溶液），按照拟定的测定条件重复测定6次，记录川续断皂苷Ⅵ峰面积，考察进样精密度，试验结果RSD为0.08%，表明进样精密度良好。

2.7溶液稳定性试验

取新配制的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液及供试品溶液，分别在0，2，4，8，12小时进样，每次进样10μL，记录川续断皂苷Ⅵ峰面积，试验结果显示，对照品溶液及供试品溶液均在12小时内稳定性良好（RSD小于2%）。

2.8重复性试验

取本品（批号：20131129），称取6份，按拟定方法制备供试品溶液，测定川续断皂苷Ⅵ含量，试验结果RSD为1.94%，表明该方法重现性较好。

2.9回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的供试品 （批号：20131129，含量：0.8%）9份，每份约0.75 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入川续断皂苷Ⅵ对照品3，5，9 mg（每个水平3份），照拟定的方法制备供试品溶液并测定川续断皂苷Ⅵ含量，计算川续断皂苷Ⅵ的回收率，结果见表5。

表5　回收率试验结果

试验结果RSD为1.07%，回收率在98.40%～101.16%之间，表明拟定的含量测定方法回收率良好。

2.10样品测定

采用经过验证，专属性、重复性良好，准确度良好的含量测定方法，对于多批样品中的川续断皂苷Ⅵ含量进行测定，试验结果见表6。

表6　多批样品测定结果

3　讨论

为加强医疗机构制剂规范化、标准化、科学化管理，提高医疗机构制剂质量，保障公众用药安全，按《中国药典》（2010年版）及有关补充要求，遵循“科学、规范、实用”的原则，对制剂标准进行升级研究。因本制剂原制剂标准质控项目与指标与药典差距较大，本文在质量标准含量测定项目拟定过程中，对君药杜仲、续断和臣药桑寄生等均进行了前期预试验，对3种药材的化学成分或活性成分进行测试，杜仲活性成分绿原酸和桑寄生活性成分槲皮素的HPLC试验中色谱峰分离度效果不佳，而续断化学成分川续断皂苷Ⅵ的HPLC试验系统性参数较好，结合武密山等[3]报道续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外骨髓间充质干细胞向成熟骨细胞增殖和分化的作用，在基因水平上为筛选促进骨形成的有效药物提供了作用靶点，故选择作为含量测定指标。

本文的波长选择方面，参照《中国药典》（2010年版）一部续断含量测定项目，拟定以川续断皂苷Ⅵ含量作为衡量指标，在进行紫外光谱扫描后，川续断皂苷Ⅵ在212 nm波长处有最大吸收，故选择测定的波长为212 nm。

本文的含量限度确定方面，根据《中国药典》（2010年版）对于续断药材的质量控制的规定，以及本品是由续断等原药材粉直接入药，考虑转移率为90%，因此本品中川续断皂苷Ⅵ的最低含量为2.4 mg/g，结合实际测定结果（由于各批次样品的药材批次不同，因此多批样品的含量结果有一定差异），暂拟定本品中川续断皂苷Ⅵ的含量限度为：不得少于2.4 mg/g。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录XVIIIA.

[2]吴春园，王俊，高锦飚.高效液相色谱法测定仙灵骨葆胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中国现代药物应用，2014，8（17）：238-239.

[3]武密山，赵素芝，任立中，等.川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究[J].中国药理学通报，2012，28（2）：222-226.

Determ ination of AsperosaponinⅥ Content in Zhitong Zhuanggu San by HPLC

Du Jianhong，Kou Xinmin，Wang Yanli，Tu Xianqin（1 Institute for Drug and Instrument Control of Chengdu M ilitary Region，Sichuan Chengdu 610017，China；2 Bayi Orthopedics Hospital of Chengdu M ilitary Region，610015）

Objective：To develop a HPLC method for determination of asperosaponinⅥ content in zhitong zhuanggu san.M ethods：HPLC analysis was carried out on a C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），using acetonitrile-water（30∶70）as mobile phase at a flow rate of 1.0 m L/min.The detection wavelength was 212 nm，while the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10μL.Results：The linear range of asperosaponinⅥwas 10.22～204.44μg/mL（n=7，r＝0.999 3）.The average recovery was 98.40%～101.16%（n=9），w ith a RSD of 1.07%.Conclusion：The method is simple，accurate and specific，which may be used for the quality control of zhitong zhuanggu san.

Zhitong Zhuanggu San；AsperosaponinⅥ；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.005

军队医疗机构制剂标准提高科研专项课题（14ZJZ15-2）

杜建红，男，副主任药师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：yjsdjh@163.com

（2016-07-05）