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HPLC同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量

2016-12-03吴军红吴文中

中国合理用药探索 2016年11期
关键词:正丁醇五味子皂苷

吴军红吴文中

(1驻马店市食品药品检验所,河南 驻马店 463000;2深圳大学第一附属医院,广东 深圳518035)

HPLC同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量

吴军红1吴文中2

(1驻马店市食品药品检验所,河南 驻马店 463000;2深圳大学第一附属医院,广东 深圳518035)

目的:建立高效液相色谱法同时测定人参五味子颗粒中人参皂苷Rg1,Re,Rb1含量的方法。方法:色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈-水为流动相,梯度洗脱;检测波长为203 nm;流速1.0 m L/min;柱温30℃。结果:人参皂苷Rg1进样量在0.160~3.200μg(r=0.999 7)、人参皂苷Re进样量在0.216~ 4.320μg(r=0.999 9)、人参皂苷Rb1进样量在0.274~5.480μg(r=0.999 3)范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.63%(RSD=1.13%),98.26%(RSD=1.17%),98.74%(RSD=1.07%)。结论:本方法简单、准确,专属性强,重复性好,能同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量。

人参五味子颗粒;人参皂苷Rg1;人参皂苷Re;人参皂苷Rb1;高效液相色谱法

人参五味子颗粒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册[1],系由生晒参、五味子两味传统中药组成的复方制剂,具有益气敛阴,安神镇静功效。用于病后体虚,神经衰弱。其中人参为贵细药材,具有大补元气,生津养血,安神益智等功效,原质量标准只有人参的薄层鉴别,近年来郭强[2]曾对五味子进行了标准提高,生晒参定量分析未见文献报道。为更好地控制产品质量,提高临床疗效,本文将人参皂苷Rg1,Re,Rb1作为测定指标,建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定人参五味子颗粒中人参皂苷Rg1,Re,Rb1含量的方法,现报道如下。

1 仪器与试药

安捷伦1260型高效液相色谱仪 (G4212B二极管阵列检测器,G1329B标准自动进样器,G1316A标准柱温箱);电子天平(BP211D,十万分之一);人参皂苷 Rg1(供含量测定用,批号:110703-201027,含量以96.3%计)、人参皂苷Re(供含量测定用,批号:110754-200421)、人参皂苷Rb1(供含量测定用,批号:110704-200921,含量以92.6%计)、均购自中国食品药品检定研究院;人参五味子颗粒由广西邦琪药业集团有限公司提供(批号:141104,150402,150807);阴性样品按处方工艺,由驻马店市中医院制剂室制备;甲醇、乙腈为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(表 1);检测波长:203 nm;流速:1.0 m L/m in;柱温:30℃。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备精密称取人参皂苷Rg1对照品16.61 mg、人参皂苷Re对照品21.60 mg、人参皂苷Rb1对照品29.59 mg,置100 m L量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1 m L中含人参皂苷Rg10.160 mg、人参皂苷Re 0.216 mg、人参皂苷Rb10.274 mg)。

2.2.2供试品溶液制备[3]取本品1袋,研细,精密称取1 g,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50m L,称定质量,超声处理(功率240 W,频率45 kHz)30分钟,放冷至室温,称定质量,用70%乙醇补足减失质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 m L,蒸干,残渣用水15 m L溶解,再用水饱和正丁醇萃取3次(25,25,20 m L),合并正丁醇液,用氨试液洗2次,每次20 m L,弃去氨试液,正丁醇液浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至5 m L量瓶,即得。

2.2.3阴性样品溶液制备精密量取阴性样品1 g,按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3系统适用性试验

按照“2.1”色谱条件,吸取对照品溶液、批号为150807的供试品溶液、阴性样品溶液,自动进样10μL,记录色谱图,理论板数按人参皂苷Rg1峰计大于6 000,分离度大于1.5,阴性无干扰。见图1。

图1 混合对照品、样品、阴性样品HPLC图

2.4线性关系考察

精密吸取对照品混合溶液1.0,2.0,5.0,10.0,20.0μL,自动进样,以峰面积积分值对进样量(μg)进行回归处理,得人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷Rb1的标准曲线分别为:

Y=14.12+364.243 3X(r=0.999 7);

Y=2.482+385.122 9X(r=0.999 9);

Y=5.699+296.947 2X(r=0.999 3)。

结果表明,人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1进样量分别在 0.160~3.200,0.216~4.320,0.274~5.480μg线性关系良好。

2.5精密度试验

精密吸取上述对照品混合液10μL,连续进样6次,记录峰面积。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为0.89%,0.76%,0.94%,表明本方法精密度良好。

2.6稳定性试验

精密吸取批号为150807的供试品溶液,分别于0,1,3,6,9,12,24 h进样10μL,依法测定。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为0.91%,1.15%,1.09%,结果表明样品在24 h内性质稳定。

2.7重复性试验

取同一批号样品(150807)6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别进行测定。人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1的 RSD分别为1.26%,0.98%,1.38%,结果表明重现性良好。

2.8加样回收试验

取已知含量的批号为150807的样品1 g,共6份,分别置25 m L量瓶中,再精密加入对照品混合液 5 m L,按“2.2.2”项下方法制备,进样测定,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的加样回收率见表2。

2.9样品测定

取人参五味子颗粒样品3批各3份,以“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样测定,按外标法计算含量,结果见表3。

表2 加样回收率测定结果

表3 样品测定结果

3 讨论

3.1色谱条件的选择

按照《中国药典》及相关文献[4-6]方法确定柱型、流速和检测波长及梯度洗脱系统,通过实验发现人参皂苷Re后面、人参皂苷Rb1前面有部分杂质峰,影响其分离效果,参考了相关文献报道[7]的梯度洗脱系统按照其流动相比例变化,可以实现人参皂苷Re峰、人参皂苷Rb1峰与杂质峰有效分离,且该梯度洗脱系统能够使各峰型稳定,峰型均较好,因此采用本梯度洗脱系统。

3.2样品处理方法

本试验供试品溶液制备方法较多[8],根据该制剂处方工艺,2味药材均为浸膏提取物,排除药典的索氏提取法,根据文献报道[9-10],本试验选取了醇提正丁醇萃取氨试液洗涤和甲醇超声提取方法。通过试验,超声提取的样品在30分钟能够有效提取完全,醇提正丁醇萃取氨试液洗涤法提出的样品用水饱和正丁醇萃取3次(25,25,20 m L)能够萃取完全,氨试液洗涤,使样品处于碱性环境中,更有利于人参皂苷成分的溶出[3],也许是含量略高于超声提取的原因,具体机制需进一步研究,该样品处理最终确定为醇提正丁醇萃取氨试液洗涤。

[1]卫生部药品标准(中药成方制剂第四册)[S].北京:人民卫生出版社.1989.

[2]郭强.人参五味子冲剂质量标准研究[J].中医临床研究,2015,7(4):16-18.

[3]付娟,李家春,张海弢,等.HPLC-ELSD法同时测定益心舒片中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量[J].广东药学院学报,2015,31(1):62-65.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:8.

[5]林庆新.HPLC法测定人参三七颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1的含量[J].中国药师,2013,16(10):1527-1529.

[6]陆继伟,于建,陈曦,等.复方丹参片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志,2012,43(12):1027-1030.

[7]吴和珍,李婷婷,李菁,等.高效液相色谱法测定益智宁颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量[J].湖北中医药大学学报,2012,14(2):25-27.

[8]杨雨,郑斯文,金银萍,等.人参皂苷的提取分离方法研究进展[J].江苏农业科学,2014,42(5):214-217.

[9]郭汉文,沙东旭.HPLC-ELSD法测定人参茎叶皂苷胶囊中人参皂苷Rg1、Re的含量[J].中国药师,2013,16(4):546-547.

[10]杨丽颖,郭伟英.HPLC-ELSD法同时测定益心宁神片中5种成分的含量[J].中药材,2015,38(12):2619-2622.

Simultaneous Determ ination of Contents of Three Ginsenosides in Ginseng Schisandrae Particles by HPLC

Wu Junhong1,Wu Wenzhong2(1 Zhumadian Institute for Food and Drug Control,Henan Zhumadian 463000,China;2 The First Affiliated Hospital of Shenzhen University,Guangdong Shenzhen 518035)

Objective:To develop a HPLC method for simultane determination of the contents of ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1in ginseng fruit.M ethods:HPLC was performed on agilent eclipse XDB-C18column(4.6 mm×250 mm,5μm)w ith a mobile phase of acetonitrile-water aqueous solution by gradient elution.The detection wavelength was 203 nm,while the flow rate was 1.0 mL/min,and the column temperature was 30℃.Results:Good linear relationships were obtained w ithin the range of 0.160~3.200μg(r=0.999 7),0.216~ 4.320μg(r=0.999 9)and 0.274~ 5.480μg(r=0.999 3)for Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re and ginsenoside Rb1,while the average recovery rates were 98.63% (RSD=1.13%),98.26% (RSD=1.17%)and 98.74%(RSD=1.07%),respectively.Conclusion:This method is simple,accurate,specific,reproducible and may be used for simultaneous determination of contents of three Ginsenosides in ginseng fruit.

Ginseng Schisandrae Particles;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Re;Ginsenoside Rb1;HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.004

中华医学会美能皮肤病学研究基金(2012031206)

吴军红,男,主管药师。研究方向:中药检验及质量标准研究。E-mail:48042557@qq.com

吴文中,男,博士,主任医师、教授。主要从事Th细胞在银屑病发病机制中的作用及复方甘草酸苷对HaCaT细胞增殖和相关因子表达影响的临床和实验研究工作。通讯作者E-mail:wzwucn@163.com

(2016-06-03)

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