p53基因突变检测方法的演进和趋势

张艳霞 杨学习

·综述·

p53基因突变检测方法的演进和趋势

张艳霞1杨学习2★

p53基因是肿瘤蛋白P53（tumor protein p53）的编码基因，在维持基因组稳定、调控细胞周期和凋亡及抑制肿瘤血管生成中发挥着重要的作用。p53基因突变信息在肿瘤分子筛查诊断、预防、药物疗法选择等方面具有重要的参考价值。本文分析了p53基因与P53蛋白突变检测的重要性、突变检测方法的发展概况，如传统的DNA测序、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymor⁃phism，RFLP）、单链构像多态性（single⁃stranded conformation polymorphism，SSCP）等8类实验室常规基因突变检测策略及酵母中分离的等位基因功能分析技术（separation of gene function analysis in yeast，FA⁃SAY），近年来新兴的技术包括生物传感器、芯片、高分辨率溶解曲线（high resolutionmelting，HRM），及下一代测序技术，以期较为全面地展示现今p53及P53突变检测的整体情况，为p53或其他基因突变研究者选择突变检测方法提供参考。

p53基因；突变检测；下一代测序

1993年，P53被《科学》（science）杂志选为“年度分子”，具有“基因组卫士”的称号。作为一重要的转录因子，P53蛋白具有发现并暂停带有损伤DNA的细胞分裂、修复损伤DNA或激活损伤细胞的凋亡途径、调控细胞的正常分裂和分化、防止肿瘤发生的功能。然而，研究表明其突变几乎在所有肿瘤中是最高的，超过50％的恶性肿瘤存在p53突变［1］。p53基因（p53 gene）的高突变率，提示其

在肿瘤的发生发展中发挥着关键性的作用，p53与P53的突变检测具有重要的临床和科研意义。本文通过文献概述了p53基因与P53蛋白突变检测的重要性，并指出它在早期的肿瘤易感性评估及预防、癌症早期诊断、耐药机制及治疗方法的优化、预后判断等方面起重要作用，是肿瘤精准医疗中不可忽视的参考基因之一。其次，重点对p53突变检测相关方法的发展历史和趋势进行阐述，并从传统方法、生物传感器等新兴热点技术及下一代测序3个角度简要介绍，特别是下一代测序的发展及其在p53基因突变研究中的现状，帮助相关研究者了解p53与P53突变检测方法的整体情况，快速选择合适的检测方法。

1 p53基因及其突变检测的重要性

p53基因，编码P53蛋白，自发现以来一直是肿瘤分子生物学领域最为热门的基因之一。起初，由于癌症病人体内p53基因经常发生突变导致其蛋白功能改变，P53蛋白被视为癌蛋白。随后十多年的研究，使科学家们认识到P53实际为抑癌蛋白［2］。人类p53基因位于染色体17p13。区，全长约20 Kb，由11个外显子和10个内含子组成，因编码一种分子质量为53 KDa的蛋白质而得名［3］。P53蛋白单体全长393个氨基酸残基，至少包括3个功能：N端功能域、DNA结合域（DNA binding domain，DBD）及C端功能域。不同物种之间，DNA结合域的氨基酸序列是进化的保守序列，其编码区为5～8外显子，能与特定的DNA序列结合，既是p53基因突变多发区域，也是P53蛋白肿瘤抑制功能的关键区域。因而大多数p53突变的研究均集中于5～9号外显子。p53的DBD区每个氨基酸都可能发生点突变，但研究报道，R175、G245、R248、R249、R273、R282 6个位点的突变在癌症中高频率出现，且与癌症的发生发展紧密关联，被称为“热点突变”［4⁃5］。

p53基因突变的类型繁多，主要包括基因片段的缺失、插入缺陷，点突变引起的错义突变，及杂合性缺失。由点突变引起的错义突变比例占总体的80％［4］。不同的肿瘤中p53的突变频率、位点和形式各具特色，其突变的种类、位置和性质主要取决于组织来源和致癌物的性质。目前科学界对于p53基因的研究主要关注其在癌症发生和发展方向、癌症之间的分子联结及癌症临床治疗中的预测价值。30多年来，分子生物学的发展提高了p53基因检测的技术水平，特别是高通量测序技术的兴起，使p53基因突变检测再次受到行业的关注。p53的检测特别是核酸层面上的分析，可以在早期的肿瘤易感性评估［6］及预防［7］、癌症早期诊断［8］、耐药机制及治疗方法的优化［9⁃10］、预后判断［11⁃14］等方面发挥出更加显著的作用，也是肿瘤精准医疗中不可忽视的参考基因之一。

2 p53基因突变检测方法发展概况

用于p53突变检测的方法日新月异，本文按技术原理及时间先后综合分类，从传统方法，近年来新兴的技术包括生物传感器、芯片、高分辨率溶解曲线（high resolutionmelting，HRM），及高通量测序共3大角度进行阐述。

2.1 传统的检测方法

传统的检测方法按原理不同归类，有DNA测序、基于酶的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）连锁分析技术及其相关改良技术、单链构像多态性（single⁃stranded conformation polymorphism，SSCP）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatogra⁃phy，DHPLC）、变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradientgelelectrophoresis，DGGE）、变性梯度毛细管电泳法（degeneration gradient capillary electro⁃phoresis，CDGE）、连接酶链反应（ligase chain reac⁃tion，LCR）、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）等8类实验室常规基因突变检测策略及酵母中分离的等位基因功能分析技术（separation of gene function analysis in yeast，FASAY）［15］。

前期对几大癌症相关p53突变位点的文献研究发现，不管是对p53突变位点或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的筛查、微卫星多态性位点及其分型分析、杂合性丢失等核酸分析，还是对突变P53蛋白的定性和定量研究，大都使用了上述方法［16⁃20］。DNA测序是p53突变检测中最受信赖的检测方法，能直接准确地检出序列中的突变位点及类型；但不适合大规模临床样本的分子诊断。DHPLC、RFLP、SSCP、DGGE不能直接检出序列中未知突变的准确位点和类型，但能检出其发生的区域信息，缩减对大量样本p53基因序列分析的工作量，在p53已知突变检测及未知突变的鉴定研究中占主导地位。免疫组织化学法可直接、快速、廉价、灵敏地检测出p53基因的失

活，但变性P53的特异性抗体难得，受个体评价标准、存储条件和特殊抗体等的影响容易出现假阴性［20］，灵敏度不如基因测序。如Takam i等［21］在研究弥漫型胶质瘤中p53基因突变和免疫组化的关系时指出P53免疫组化是中度敏感和高度特异的p53基因突变的提示性标记。各传统方法在p53和P53蛋白突变检测中的典例、突变类别、优缺点如表1。

表1 传统p53突变检测方法简介表Table 1 Overview of traditional p53 mutation detectionmethods

2.2 生物传感器、生物芯片、高分辨率溶解曲线技术

生物传感器、生物芯片、高分辨率溶解曲线技术都是近年来的热点技术。生物传感器便宜、一次性、微型化、便携化，适用于大量临床样本p53突变检测［18，29］。基因芯片比Southern Blot等传统探针技术简单、通量高、集成化、应用性强，相比直接测序，突变点的检测数目更多、速度更快、准确性更高。如A ffymetrix公司的p53基因芯片，适用于肿瘤的早期诊断和易感性判断。高分辨率溶解曲线分析技术是在实时荧光PCR的基础上发展而来的，闭管操作，低污染，准确率高、通量高、经济、简单方便，且不受DNA突变位置或类型影响，后期数据分析处理方法简单易懂，适用于基因分型、短片段重复序列分析、序列匹配、突变扫描、RNA编辑及甲基化扫描等研究［30-31］。然而，基因芯片灵敏度低、探针不稳定、仪器成本高，HRM的灵敏度、精确度及系统的稳定性也有待提高。

2.3 下一代测序的发展及其在p53基因突变研究中的概况

下一代测序（next⁃generation sequencing，NGS）又称高通量测序（high⁃throughputsequencing）或大规模平行测序（massively parallel signature sequenc⁃ing，MPSS），是比基因芯片更高通量、更低成本的研究方法。自2005年Roche公司推出的第一台高通量测序仪来，市场上主要有3大成熟的高通量平台即Roche公司的GSFLX测序系统，Illumina公司的Solexa基因组分析仪和ABI公司的SOLiD测序仪。早期，3类平台存在通量太大、实验周期长、成本高的问题，常应用于重大项目的大规模测序或基础研究领域，不适应医疗领域的临床诊断、分子诊断。为满足中小实验室研究及医院检测的需求，3大公司相继推出了低成本、低通量的测序平台，如Life Tech的Ion Torrent（Personal Genome Machine、Proton）、Illum ina的M iseq及Roche的GS Junior［32］。Ion Torrent平台将半导体芯片技术

与化学反应独特地结合起来，利用检测DNA合成时释放的氢离子造成电位差（pH改变）的原理进行测序，能直接将序列信息转变成电信号，避免了原3大高通量平台所需的复杂精密的光学拍照系统，还有多种测序长度及芯片的通量大小可供选择。具有快速、准确、灵活、成本低、操作简单等优势。M iseq是Illum ina的个人型测序系统，在单个仪器上整合了扩增、测序及数据分析的功能，并配备专门的样本制备试剂盒，大大缩减了人工操作和仪器运行的时间；还具有强大的数据处理功能，可使用其内置软件进行拼接、比对等基本分析，也能借助在线BaseSpace系统，利用其中专业的大型数据分析软件，很大程度地解决了中小型客户在数据分析和存储等方面的困难。GS Junior也是精巧型测序仪，具有长读长的独特优势，适应医院及中小实验室对特定基因进行长片端测序。此外，更多的中等通量的测序平台正被研发出来。

下一代测序能检出肿瘤基因组内基因的点突变、碱基替换、拷贝数改变和插入与缺失等，研究者们纷纷将其用于肿瘤全基因组、转录组、全外显子组等研究。但前期对国内外p53突变位点与癌症相关性的文献研究过程中发现，目前国内单独使用下一代测序检测p53的案例相对稀少，但个别案例使用全外显子捕获测序法筛查了肝癌［33］和肺癌［34］突变位点，并以Sanger法或质谱法进行检验，指出下一代测序技术在体细胞突变位点鉴定或筛查中具有可行性。不同的是国外已经有大量p53突变相关研究使用了通量测序，并与一代测序、FASAY、核酸质谱［35］及免疫组化等传统技术做了对比实验。由于肿瘤细胞异质性等原因，不同的案例对于下一代测序在p53突变检测中的效果说法不一。

总体而言，基于个体的异质性，单独检测p53基因突变的参考价值是有限的，在肿瘤或其他疾病与基因的相关性研究中，多数情况下同时检测其他相关的参考基因和位点所得的综合信息更有意义。虽然下一代测序的特异性和灵敏度还有待提高，但其在突变比例高的已知样本检出率较高，较其它方法通量高、快速、经济，有望成为精准医疗时代中检测p53等基因突变的得力手段。

3 总结和展望

p53突变类别多、位点多，已有的检测方法各有优缺，至今尚未出现一种能独立取代所有p53突变研究的方法。p53突变检测方法朝高灵敏度、高精确度、实时、快速、经济、自动化、突变类型集成化的趋势发展。因此，实际中应结合具体研究目的、p53的突变类型和客观条件，合理、综合其中一种或多种方法以快速准确地检出p53突变。下一代测序具有高效、所需DNA量少、可同步分析多个基因、多种突变类别的独特优势，且随着组织微切割、靶向捕获和肿瘤细胞捕获技术、等温扩增PCR等精准技术的出现，其费用高、周期长、错误率高、读长短等问题的逐步得到解决，已经成为精准医疗时代中最引人瞩目、最得力的分子诊断技术。

［1］Olivier M，Eeles R，Hollstein M，et al.The IARC P53 database：new onlinemutation analysisand recom⁃mendations to users［J］.Human mutation，2002，19（6）：607-614.

［2］Ben DY，Prideaux VR，Chow V，et al.Inactivation of the p53 oncogene by internal deletion or retroviral integration in erythroleukem ic cell lines induced by Friend leukem ia virus［J］.Oncogene，1988，3（2）：179-185.

［3］M iller C，Mohandas T，Wolf D，et al.Human p53 gene localized to shortarm of chromosome 17［J］.Na⁃ture，1986，319（6056）：783-784.

［4］李大虎，张令强，贺福初.突变体p53研究进展［J］.遗传，2008，30（6）：697-703.

［5］Muller PA，Vousden KH.Mutant p53 in cancer：new functions and therapeutic opportunities［J］.Cancer cell，2014，25（3）：304-317.

［6］Wu D，Zhang Z，Chu H，et al.Intron 3 sixteen base pairs duplication polymorphism of p53 contributes to breast cancer susceptibility：evidence from meta⁃analy⁃sis［J］.Plos One，2013，8（4）：e61662.

［7］Bhowm ik A，Das S，Bhattacharjee A，et al.MDM 2 and P53 Polymorphisms as Predictive Markers for Head and Neck Cancer in Northeast Indian Popula⁃tion：Effect of Gene⁃Gene and Gene⁃Environment In⁃teractions［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（14）：5767-5772.

［8］李琪，肖贵华，程长浩，等.非小细胞肺癌BALF中RAR⁃β基因甲基化与p53突变检测及相关性研究［J］.重庆医学，2015，44（23）：3206-3209.

［9］Elhag R，Mazzio EA，Soliman KF.The effectof silib⁃inin in enhancing toxicity of temozolom ide and etopo⁃side in p53 and PTEN⁃mutated resistant glioma cell

lines［J］.Anticancer Res，2015，35（3）：1263-1269.

［10］代晓丽，刘静，罗瑛，等.靶向作用p53药物的研究进展［J］.中国药理学通报，2014，30（7）：912-916.

［11］Malcikova J，Pavlova S，Kozubik KS，etal.P53muta⁃tion analysis in clinical practice：lessons from chronic lymphocytic leukemia［J］.Humanmutation，2014，35（6）：663-671.

［12］Uji K，Naoi Y，Kagara N，et al.Significance of P53 mutations determined by next⁃generation“deep”se⁃quencing in prognosis of estrogen receptor⁃positive breast cancer［J］.Cancer letters，2014，342（1）：19-26.

［13］Bally C，Adès L，Renneville A，etal.Prognostic value of P53 gene mutations in myelodysplastic syndromes and acutemyeloid leukem ia treated w ith azacitidine［J］. Leuk Res，2014，38（7）：751-755.

［14］Morikawa T，Kuchiba A，Liao X，etal.Tumor P53 ex⁃pression status，body mass index and prognosis in colorectal cancer［J］.Int J Cancer，2012，131（5）：1169-1178.

［15］江铁山.几个与癌症相关基因（AP-2β，P53，NOD2）的研究［D］.长沙：湖南师范大学，2005.

［16］铁剑，解云涛，徐晔，等.p53基因codon 72多态性与乳腺癌术后放化疗疗效相关性分析［J］.中国肿瘤临床，2015，42（3）：152-156.

［17］张海勇，危晓莉，王玲玲，等.结直肠腺癌中神经内分泌细胞微卫星改变和p53基因突变的检测［J］.中华病理学杂志，2013，42（1）：10-14.

［18］Altintas Z，Tothill I.Biomarkers and biosensors for the early diagnosis of lung cancer［J］.Sensors＆amp;Actuators BChem ical，2013，188（188）：988-998.

［19］张萌.毛细管电泳在癌症诊断中的应用研究［J］.职业技术，2015，14（12）：88-89.

［20］Watanabe G，Ishida T，Furuta A，etal.Combined im⁃munohistochem istry of PLK 1，p21，and p53 for pre⁃dicting TP53 status:an independentprognostic factor of breast cancer［J］.Am JSurg Pathol，2015，39（8）：1026-1034.

［21］Takam iH，Yoshida A，Fukushima S，etal.Revisiting P53mutations and immunohistochem istry—a compara⁃tive study in 157 diffuse gliomas［J］.Brain Pathol，2015，25（3）：256-265.

［22］Malcikova J，Stano⁃Kozubik K，Tichy B，et al.De⁃tailed analysis of therapy⁃driven clonal evolution of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia［J］. Leukemia，2015，29（4）：877-885.

［23］Kim HW，Lee HM，Hwang SH，etal.Patternsand bio⁃ logic features of p53 mutation types in Korean breast cancer patients［J］.JBreast Cancer，2014，17（1）：1-7.

［24］杜明，丰有吉.DHPLC和DDF检测散发性卵巢癌p53基因突变的应用［J］.中国临床医学，2006，13（1）：108-111.

［25］金明娟，张勇晶，张爽爽，等.P53基因多态性与结直肠癌易感性的关联研究［C］//全国肿瘤流行病学肿瘤病因学学术会议论文集，2007.

［26］俞星，金昱.延边地区P53基因-72密码子多态性与宫颈癌预后的相关性［J］.延边大学医学学报，2015（4）：252-254.

［27］Sørlie T，Johnsen H，Vu P，et al.Mutation screening of the TP53 gene by temporal temperature gel electro⁃phoresis（TTGE）［J］.Methods Mol Biol，2014，1105：315-324.

［28］Lian DS，Zhao SJ.Capillary electrophoresis based on the nucleic acid detection in the application of cancer di⁃agnosis and therapy［J］.Analyst，2014，139（14）：3492-3506.

［29］Sun Y，Lu X，Su F，et al.Real⁃time fluorescence li⁃gase chain reaction for sensitive detection of single nu⁃cleotide polymorphism based on fluorescence reso⁃nance energy transfer［J］.Biosens Bioelectron，2015，74：705-710.

［30］陈斌，雷秀霞，周小棉.高分辨率熔解曲线技术及其在分子诊断中的应用进展［J］.分子诊断与治疗杂志，2009，1（2）：120-124.

［31］Ihle MA，Fassunke J，König K，et al.Comparison of high resolution melting analysis，pyrosequencing，next generation sequencing and immunohistochem istry to conventional Sanger sequencing for the detection of p. V600E and non⁃p.V600E BRAFmutations［J］.BMC cancer，2014，14（1）：1.

［32］李明辉，杨振兴，侯睿，等.下一代测序技术在临床检测中的应用［J］.生物产业技术，2013，6：18.

［33］代继红.原发性肝癌基因突变谱的鉴定及分化相关基因表达特征的分析［D］.上海：华东理工大学，2013.

［34］胡桂林.肺癌组织内不同肿瘤细胞群体异质性与基因组变异［D］.北京：中国科学院北京基因组研究所，2012.

［35］Quinn AM，Hickson N，Adaway M，et al.Diagnostic mutation profiling and validation of non⁃small⁃cell lung cancer small biopsy samples using a high throughput platform［J］.JThorac Oncol，2015，10（5）：784-792.

Evolution and trendsof the detectionmethods for p53 genemutation

ZHANG Yanxia1，YANG Xuexi2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.Schoolof Labora⁃tory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

p53 gene is the tumor protein P53⁃coding⁃gene.Tumor protein P53 plays important roles in keeping genom ic stability,regulating and controlling cell cycle and cell apoptosis aswell as suppressing an⁃giogenesis of tumors.p53 genemutation information can provide great reference value formolecular screening or diagnosis,prognosis of tumors and optimal choices in drugs or treatments,etc.By analyzing or introducing p53 gene and protein P53 and the importance of theirmutation detection,development status of methods for their mutation detection,such as 8 categories of traditional and conventional laboratory methods including DNA sequencing,restriction fragment length polymorphism(RFLP）,single⁃stranded conformation polymor⁃phism(SSCP）and separation of gene function analysis in yeast(FASAY），and emerging technologies includ⁃ing bio⁃sensor chip,high resolution melting(HRM)and the next generation sequencing technology.This re⁃view may help readers quickly learn the overall situation ofmutation detection of p53 and P53 and provide in⁃vestigatorsw ith useful reference on the p53 and other genemutation detectionmethods.

p53 gene；Mutation detection；Nextgeneration sequencing

南方医科大学课外科研学术活动（2009kw109）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

★通讯作者：杨学习，E⁃mail：yxxzb@sohu.com