阳性水牛、黄牛IgG筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

冯金涛，韩 愉，袁 炜，张 欣，许 瑞，李 浩，陆 珂，金亚美，林矫矫，程国锋，刘金明

（中国农业科学院上海兽医研究所 国家防治动物血吸虫病专业实验室 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

·研究论文·

阳性水牛、黄牛IgG筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

冯金涛，韩 愉，袁 炜，张 欣，许 瑞，李 浩，陆 珂，金亚美，林矫矫，程国锋，刘金明

（中国农业科学院上海兽医研究所 国家防治动物血吸虫病专业实验室 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

为寻找有效的家畜日本血吸虫病诊断抗原，从感染日本血吸虫的水牛、黄牛血清中纯化IgG，以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫（44日龄）噬菌体展示 cDNA 文库。经每种动物IgG三轮（总计六轮）筛选后, 随机挑取 53 个阳性噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析。获得了9个EST 序列，其中7个EST序列与已知基因或表达序列标签同源，2个 EST 序列与已知基因或表达序列标签均无同源性，以噬菌体展示载体的 10B 衣壳蛋白开放阅读框（open reading frame，ORF）为依据，对上述 7个与 GenBank 数据库资料同源的 EST 进行对码分析，结果 7个EST序列能和噬菌体展示载体阅读框对码，为有效展示序列。其中3个EST具有较高的重复度，在51个有效克隆中，25个为HSP70 homolog基因，15个为Keratin9基因有重复，6个为Ornithine--oxo-acid transaminase基因。研究结果显示，HSP70 homolog基因、Keratin9基因和Ornithine--oxo-acid transaminase基因作为诊断家畜血吸虫病候选抗原基因，值得进一步开展克隆、表达和诊断效果评估方面的研究。

日本血吸虫；水牛；黄牛；筛选；噬菌体展示 cDNA 文库

血吸虫病发生在热带和亚热带，是世界范围内最重要的寄生虫病，血吸虫病的防控具有重要的社会经济意义[1]。血吸虫病在74个国家流行，大约1亿2千万人为有症状性感染，2千万人受到严重影响[2]。尽管在低感染度下血吸虫很少引起死亡，但是它的复发特性使血吸虫感染成为终身失调的慢性病[3]。日本血吸虫病在中国长江中下游沿岸5省（湖南省、湖北省、江西省、安徽省和江苏省）以及四川省、云南省2省流行。虽然我国血吸虫病防控已取得显著成效，但迄今为止仍然是主要的公共卫生问题之一。2013年底全国仍有血吸虫病患者约184 943例，其中急性血吸虫感染病例9例，当年死亡1700例[4]。2012年在湖南省、湖北省、江西省、安徽省、江苏省、四川省、云南省7个流行省，牛血吸虫病的粪便毛蚴孵化法检测阳性率为0.58%，推算的理论病牛数为5284头[5]。

患病家畜特别是病牛，是我国血吸虫病的最重要传染源，因此及时发现病畜并给予治疗是有效控制传染源的重要途径。长期以来，家畜血吸虫病的诊断和监测主要采用病原学诊断技术—粪便毛蚴孵化法。随着我国血吸虫病防控和疫情控制取得巨大成就，我国家畜血吸虫感染率和感染度越来越低，传统的病原学诊断技术在发现病畜和确定治疗对象方面越来越困难。免疫学诊断技术主要采用虫卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）检测抗体的技术，包括ELISA、IHA等，但SEA抗原和其他吸虫如片型吸虫感染血清有较高的交叉反应[6]。虽然在基因工程诊断抗原研究方面已有不少报道，但目前还没有一种基因工程抗原可以开展大规模的应用，继续筛选敏感特异的诊断抗原是我国血吸虫病防治的一大需求。本研究用感染日本血吸虫家畜的IgG筛选日本血吸虫成虫 T7 噬菌体展示 cDNA 文库，以期发现能用于后续研究的家畜日本血吸虫病诊断抗原基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、实验动物日本血吸虫成虫（Sj44d）噬菌体展示 cDNA 文库由本研究室构建、保存，库容量为4.98×106pfu，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp[7]。血吸虫尾蚴由本研究室钉螺室提供；水牛、黄牛血吸虫阳性血清（粪检阳性）为本研究室用日本血吸虫尾蚴攻击感染后采集、保存。

1.1.2 主要试剂 Protein G亲和层析柱购自GE公司；盐酸胍购自华美生物工程公司；BSA（Fraction Ⅴ）购自 BBI公司；binding/wash buffer和elution buffer购自生工生物工程（上海）有限公司；T7噬菌体载体引物序列由 T7 Select 10-3b Cloning Kit 说明书提供，Invitrogen公司合成，上游引物序列为5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'，下游引物序列为5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'。

1.2 方法

1.2.1 水牛、黄牛日本血吸虫阳性血清抗体纯化 按照产品说明书，用Protein G亲和层析柱亲和层析纯化IgG。主要步骤如下：分别取实验室保存的水牛、黄牛两种动物阳性血清各10份，4℃融化过夜后，每份取100 μL合并，用日本血吸虫虫卵可溶性抗原（SEA）进行常规ELISA验证血清为阳性后，加入1倍体积结合缓冲液，上下颠倒10次混匀，4℃、12 000×g离心6 min，小心吸取上清，用0.45 μm滤器过滤。将Protein G柱（1 mL）在室温平衡5 min，用5倍柱体积的灭菌二级水洗柱后，加入5倍柱体积结合缓冲液平衡。待结合缓冲液流尽后，加入上述过滤血清。待血清样品流尽，分别加入10倍柱体积结合缓冲液和0.5 mL 洗脱缓冲液洗涤，流尽后再加入5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，用EP管收集洗脱液，每管1 mL。以空白洗脱缓冲液作空白对照，用紫外分光光度计初步测定各收集管蛋白浓度。将洗脱纯化后的抗体，用12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，测定纯化抗体纯度，将高蛋白浓度且纯度达到要求的各管抗体合并，按照说明书以BSA为标准蛋白，用BCA法检测洗脱纯化后抗体浓度。

1.2.2 噬菌体文库扩增 将宿主菌BLT5403接种于M9LB 培养基（Amp+），于37℃、200 r/min 摇床培养至吸光度OD600=1.0。将超低温冰箱中保存的原始文库解冻后与宿主菌液按 100:250 比例混匀，37℃作用 10～20 min，再与顶层琼脂混合，铺于 120 mm LB 平板顶层，37℃倒置培养 3～4 h。然后每块板加 10 mL 噬菌体提取缓冲液，4℃存贮过夜，d2收集噬菌体提取缓冲液，加入0.5 mL氯仿混合均匀，3000×g离心 5 min，收集上清。

1.2.3 噬菌体滴度测定 将文库或每轮筛选获得的噬菌体分别用1×TBS按1:10比例稀释，每个稀释度各取100 μL，加入250 μL BLT5403培养菌液（OD600=1.0）中，混匀后37℃孵育20 min，加入3 mL冷却至55℃的顶层琼脂，上下颠倒混匀后迅速平铺含1‰氨苄（氨苄浓度为100 mg/mL）琼脂平板上，37℃培养箱倒置培养3～4 h，将平板上的噬菌斑进行计数，计算噬菌体的滴度（pfu/mL=噬菌斑个数×10×稀释倍数）。

1.2.4 噬菌体展示文库的筛选 将洗脱纯化后抗体用CB 稀释至蛋白含量为 10 μg/mL，按每孔100 μL加至 96 孔酶标板中，4℃过夜，TBST洗涤3次，每次置于摇床振荡5 min。加入1%明胶（200 μL/孔），37℃封闭 1 h，TBST清洗5 次，每次置于摇床振荡 5 min。将扩增文库按每孔100 μL 加入板中，37℃孵育 1 h。TBST清洗 5 次，每次置于摇床振荡 5 min。每孔加 2 mol/L 盐酸胍 200 μL，室温孵育 20 min 后洗脱。收集洗脱液，按上述文库扩增方法用宿主菌BLT5403 扩增并测定滴度后用于下一轮筛选。水牛纯化抗体进行3轮筛选后，洗脱下噬菌体，继续用黄牛纯化抗体进行3轮筛选，共连续进行6轮筛选。

1.2.5 插入片段的序列测定及生物信息学分析 从6 轮筛选后扩增平板上随机挑取噬菌斑，浸入噬菌体提取缓冲液，用 T7 噬菌体载体引物以PCR方法扩增插入片段。PCR条件：94℃热变性5 min；94℃变性50 s、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸6 min。 取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将 PCR 产物送 Invitrogen 公司用T7 噬菌体载体引物测序。

将测序所得序列用 DNAStar MegAlign 软件进行聚类分析，获取非重复序列，用BLASTn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)）在 GenBank 数据库中进行同源性搜索，对已搜索到同源性的序列，用 Protein Blast 和tblastn（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）以及 Translation To（http://www.expasy.org/tools/dna.htmL）分析所获取序列与T7 噬菌体载体是否对码。用InterProScan（http//www.ebi.ac.uk/interpro/）和PROSITE（http://www.expasorg/ prosite/）等数据库预测这些序列编码蛋白可能参与的生物学过程、分子功能及包含的结构域。

2 结果

2.1 水牛、黄牛日本血吸虫阳性血清IgG纯化 将收集的日本血吸虫的水牛、黄牛血清分别经Protein G亲和柱层析纯化，各得到5管洗脱液，纯化抗体经SDS-PAGE电泳后在50 kDa和25 kDa有两条明显的条带（图1），无其他杂条带，说明经Protein G亲和柱层析纯化血清后，得到了较纯净的抗体。 纯化抗体浓度：水牛870 μg/mL，黄牛1500 μg/mL。

图1 利用Protein G 纯化两种动物IgGFig.1 Purifi ed IgG from the two animals by Protein G

2.2 噬菌体展示文库的筛选 用纯化的水牛、黄牛IgG，依次对文库进行淘洗筛选，每种动物进行3轮筛选，每轮筛选之后检测筛选洗脱液中的噬菌体滴度和扩增之后测滴度。6轮筛选过程中噬菌体的投入、洗脱数量和富集程度结果见表1。从表中可以看出同种动物IgG的第2轮筛选的富集度比第1轮高，第3轮筛选的富集度比第2轮略有提高，说明与抗体结合的噬菌体量得到富集，经过6轮筛选后去除了非特异性结合和低亲和力的噬菌体。

2.3 插入片段的序列测定及生物信息学分析 从第 6轮筛选后扩增平板上随机挑取 53个阳性菌体克隆进行测序，经归类分析后得到9个 EST序列。利用BLAST 软件搜索这9个 EST在GeneBank 中的同源序列，其中7个与已登录的血吸虫已知基因相匹配，2个与数据库中数据没有同源性。以噬菌体展示载体的 10B 衣壳蛋白开放阅读框（open reading frame，ORF）为依据，对上述 7个与 GenBank 数据库资料同源的 EST 进行对码分析，结果 7个EST序列能和噬菌体展示载体阅读框对码，为有效展示序列。

在7个与已登录的血吸虫已知基因相匹配的EST序列中，编码HSP70 homolog的基因有25个重复，编码Keratin 9的基因有15个重复，编码Ornithine--oxo-acid transaminase的基因有6个重复，编码Protein BUD31 homolog的基因有2个重复，为筛选出的重复较多的EST序列。筛选出的其他基因序列均没有重复，其生物信息学分析结果如表2。

表1 6轮筛选的噬菌体富集结果Table1 The phages enrichment results by two kinds of serum after six rounds of biopanning

表2 阳性克隆的生物信息学分析Table2 Bioinformatic analysis of the positive clones

3 讨论

黄牛与水牛一直被认为是我国血吸虫病传播的重要宿主[8]。目前对血吸虫病诊断候选抗原基因的研究，大多数均以人群血吸虫病诊断为目的。由于动物宿主在抗原递呈方面存在差异，可能导致其在感染血吸虫后血清抗体对血吸虫抗原的反应也存在差异。家畜血吸虫病诊断抗原的选择应考虑宿主免疫的差异性，一方面需对已报道的候选基因重组抗原进行家畜血吸虫病诊断效果评估，另一方面还需筛选适合不同家畜品种的抗原基因。本研究分别从曾感染血吸虫的水牛和黄牛血清中纯化IgG，筛选日本血吸虫噬菌体展示文库，期望获得能同时诊断水牛和黄牛日本血吸虫病的抗原基因。

噬菌体展示技术可将编码蛋白质的 DNA 序列插入到噬菌体基因组中，使表达的目标多肽或蛋白以与内源蛋白融合的形式展示在噬菌体颗粒表面[9]，该技术使表达产物与其编码基因在同一噬菌体颗粒上建立起一一对应的关系，并且被展示的外源肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性[10]，筛选出的噬菌体阳性克隆，本身可以直接作为候选重组诊断抗原，用于诊断效果的评估，同时也可以得到具有诊断价值的候选靶基因。筛选出的噬菌体阳性克隆，重复数量越多，表明该噬菌体阳性克隆在逐级筛选过程中富集程度越高，更易筛选出的具有较高诊断价值的噬菌体阳性克隆。本研究筛选出的HSP70 homolog 基因为筛选出的重复数最高的基因，日本血吸虫HSP70（Grp78）基因，曾被报道具有高度的抗原特异性，并具有一定的早期诊断与疗效考核潜能[11]。Keratin9基因为日本血吸虫的卵壳蛋白基因的一部分，唐小牛等[12]、张莉等[13]曾尝试对此基因进行原核克隆表达，研究其作为候选疫苗分子和诊断抗原的可能性，但未见后续报道。刘兰英等[14]通过构建真核表达质粒，在Hela细胞中高效表达卵壳蛋白，表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。鸟氨酸转氨酶在血吸虫中的特性尚无报道，对脊椎动物的研究发现，作为尿循环中的最后一个酶，鸟氨酸转氨酶的主要作用是解毒，存在于血细胞中。Lu等[15]采用纯化的抗血吸虫全虫蛋白的IgY 作为捕捉抗体，对感染血吸虫病患者的血清进行筛选，获得了4个可能具有诊断价值的循环抗原，其中包括Protein BUD31 homolog。

由于淘洗法筛选噬菌体文库的假阳性较高，难以用阴性血清IgG进行扣除，本研究筛选获得的基因的表达产物是否能用于家畜血吸虫病的诊断，还需后续对相关基因进行克隆、表达后验证。

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SCREENING OF A PHAGE DISPLAY CDNA LIBRARY OF SCHISTOSOMA JAPONICUM WITH IGG FROM INFECTED BUFFALO AND CATTLE

FENG Jin-tao, HAN Yu, YUAN Wei, ZHANG Xin, XU Rui, LI Hao, LU Ke, JIN Ya-mei, LIN Jiao-jiao, CHENG Guo-feng, LIU Jin-ming
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, National Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Shanghai Veterinary Research Institute ,CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to fi nd the effective diagnostic antigen for S.japonicum infection in domestic animals, IgG preparations were purifi ed from serum samples of infected buffalo and cattle and used to screen a phage display cDNA library from 44-day-old worms.After a total of six rounds of biopanning, 53 positive clones were randomly picked and sequenced and 9 ESTs including 2 unnamed ESTs were obtained.With open reading frame (ORF) of 10B capsid protein in phage display vector as the basis, 7 ESTs were determined to be effective display sequences.Among the 7 effectively displayed ESTs, 3 ESTs had higher multiplicity.Among the 51 positive clones sequenced, 25 clones were HSP70 homolog, 15 clones were Keratin 9 and 6 clones were Ornithine-oxo-acid transaminase.These results obtained here suggested that the genes encoding HSP70 homolog, Keratin 9 and Ornithine-oxo-acid transaminase might be relevant to the candidate diagnostic antigens for detection of S.japonicum infection in domestic animals.

Schistosoma japonicum; buffalo; cattle; screening; phage display cDNA library

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0062-06

2015-12-28

公益性行业（农业）科研专项经费（201303037）；农业部动物疫情监测与防治

冯金涛，男，硕士研究生，预防兽医学专业

刘金明，E-mail：jimyliu@shvri.ac.cn