小麦成熟胚高效再生基因型筛选及愈伤组织生理特性评价

汤 益，王志成，崔桂宾，孙风丽，张 超，刘曙东，奚亚军

(1.西北农林科技大学农学院/农业部西北地区小麦生物学与遗传育种重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省宝鸡市陇县种子管理站，陕西陇县 721200)



小麦成熟胚高效再生基因型筛选及愈伤组织生理特性评价

汤 益1，王志成2，崔桂宾1，孙风丽1，张 超1，刘曙东1，奚亚军1

(1.西北农林科技大学农学院/农业部西北地区小麦生物学与遗传育种重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省宝鸡市陇县种子管理站，陕西陇县 721200)

为了提高小麦组织培养效率，筛选可用于遗传转化的小麦高效再生基因型，通过比较56个小麦品种(系)成熟胚组织培养的出愈率、胚性愈伤率、褐化率、分化率、实际成苗率和单位数量成熟胚的理论成苗率，对其组培能力进行了鉴定，并研究了成熟胚愈伤组织形成过程中部分生理性状的变化情况。结果表明，筛选出了XNCW2、鲁麦14、宝丰228、XNCW4、徐州856、陕150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04和新麦11共10个具有高频再生能力的小麦品种(系)，实际成苗率均在20%以上，单位数量成熟胚的理论成苗率在5%以上。不同基因型小麦成熟胚的出愈率、胚性愈伤率、分化率、实际成苗率和单位数量成熟胚的理论成苗率的变异系数分别为14.94%、73.95%、84.89%、109.47%和156.54%，说明组织培养从脱分化到成苗的过程中对小麦基因型的依赖性逐渐增强。愈伤组织的SOD活性与胚性愈伤率和成苗率显著正相关，表明SOD活性较强的愈伤组织再生能力较强；可溶性蛋白含量与褐化率极显著正相关，表明可溶性蛋白含量更高的愈伤组织再生能力较弱。

小麦；成熟胚；再生；组织培养；生理指标

小麦是我国主要粮食作物之一，转基因技术是提高小麦产量、品质和抗逆性的重要手段[1-2]，但小麦组织培养技术的瓶颈和高效再生材料的缺乏制约了小麦遗传转化的研究[3-4]。自1992年Vasil等[5]以幼胚的愈伤组织为材料将Gus和Bar基因转入小麦中以来，由幼胚、花药、幼穗和成熟胚等组织诱导而成的愈伤组织都曾作为小麦遗传转化的受体材料[6-8]。但幼胚、花药、幼穗等外植体受到取材时间和季节的限制，无法满足转基因对受体的大量需求，而以成熟胚为组织培养材料没有取材时间和季节的限制，已成为小麦组织培养的理想材料[9-10]。成熟胚的处理方式[11-12]、外源植物激素的添加[8, 13]、不同的小麦基因型[14]都会对成熟胚愈伤组织的形成和分化造成影响。Bi等[14]研究发现，不同基因型小麦成熟胚的再生能力存在极大差异，成熟胚组织培养对基因型的依赖性极强。张东武等[13]利用不同的成熟胚处理方式和激素配比对小麦成熟胚进行了诱导和再生，认为成熟胚纵切和培养基的适当激素配比对高效再生基因型的筛选有利。陈俊南等[15]从培养基入手，认为不同基因型都有其最适宜的培养条件，培养基的不恰当选择对筛选结果影响较大。关于成熟胚高效再生基因型的筛选前人做了较多研究，但主要集中在对诱导和再生体系的优化，可供利用的成熟胚高效再生基因型仍较少，成苗率不够理想，需进一步挖掘。

愈伤组织的生理状况会表征其分化能力，这在其他作物中已有许多报道。张献龙等[16]报道，棉花的胚性愈伤中较低的糖和淀粉含量、较高的可溶性蛋白含量可能代表更高的分化能力，前者为胚状体的形成消耗了能量，后者为细胞分化打下物质基础。Cui等[17]在枸杞的愈伤组织中发现，适度的内源H2O2可以促进体细胞胚的形成，内源H2O2相对较高的愈伤组织分化能力较强。Hao等[18]在燕麦中发现，胚性愈伤组织的超氧化物歧化酶(SOD)活性强于非胚性愈伤，丙二醛(MDA)含量低于非胚性愈伤组织。在小麦中，Yang等[19]报道了由成熟胚和幼胚产生的愈伤组织中多酚含量与分化率和再生率正相关，可溶性糖含量与分化率和再生率负相关。但目前关于小麦胚性愈伤组织生理特征的报道相对较少。

鉴于此，本试验拟对56个小麦品种(系)的成熟胚进行愈伤组织的诱导和分化，并对其愈伤组织的生理性状进行评价，以期进一步探明小麦成熟胚高效再生基因型愈伤组织的生理特征，并筛选出小麦成熟胚高效再生基因型。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试的56份小麦品种(系)(表1)均由西北农林科技大学农学院奚亚军教授课题组提供。

1.2 小麦组织培养

1.2.1 种子灭菌

选取均匀饱满的小麦种子，根据Chugh和Khurana[20]的灭菌方法，先用70%酒精处理5 min，无菌水漂洗5次，再用25%次氯酸钠灭菌20 min，无菌水漂洗5次，封口膜封口后暗过夜浸泡10 h，次日再于4 ℃环境浸泡4 h，在超净台上再用25%次氯酸钠消毒15 min，无菌水漂洗5次。

1.2.2 成熟胚愈伤组织的诱导和分化

用经高温灭菌冷却处理后的镊子从小麦种子中取出成熟胚后刮碎并接种于诱导培养基上(pH 5.8，MS +8 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1水解酪蛋白+0.5 mg·L-12, 4-D+2.2 mg·L-1Picloram，每皿50个，3次重复)，暗培养21 d诱导愈伤组织，温度为24±1 ℃，统计出愈率，35 d后统计胚性愈伤率。挑选生长良好的胚性愈伤组织转入分化培养基(pH 5.8，MS + 8 g·L-1琼脂+ 30 g·L-1蔗糖+ 1 mg·L-1KT)进行光照培养，培养条件为光强12 000 lx，光照16 h·d-1，温度为24±1 ℃，21 d后统计愈伤组织分化率和褐化率。

1.2.3 再生苗的生根诱导和移栽

待再生苗长至3～5 cm长时转入生根培养基(pH 5.8，1/2 MS+8 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖)，与分化培养相同条件下培养21 d，统计愈伤组织成苗率。

1.3 取材和性状测定

取成熟胚诱导培养21 d后的愈伤组织迅速放入液氮中，用于SOD、POD活性测定和可溶性蛋白、丙二醛含量测定。同时，另取同时期的愈伤组织测定鲜重、干重和含水量(每个基因型取20粒愈伤进行测定)。SOD活性测定采用NBT光还原法[21]，POD活性测定采用愈创木酚法[22]，可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、鲜重、干重和含水量的测定采用高俊凤等[23]的方法。

1.4 数据处理与分析

愈伤组织的统计参考Yan等[24]的方法，出愈率=产生愈伤的成熟胚数/接种成熟胚数×100%，胚性愈伤率=产生胚性愈伤的成熟胚数/接种成熟胚数×100%，分化率=分化出绿芽的愈伤组织块数/接种胚性愈伤数×100%，褐化率=发生褐化的胚性愈伤组织数目/接种胚性愈伤数×100%，实际成苗率=生根成苗的愈伤组织块数/接种胚性愈伤数×100%，单位数量成熟胚的理论成苗率=胚性愈伤率×实际成苗率×100%(假设所有产生胚性愈伤的成熟胚都形成了理想的愈伤，且数量相同)。其他数据处理和分析采用Excel 2013和IBM SPSS Statistics 19软件进行。

2 结果与分析

2.1 供试小麦品种(系)中的高频再生基因型

不同小麦品种(系)的出愈率、胚性愈伤率、分化率、实际成苗率、褐化率、单位数量成熟胚的理论成苗率见表1。从整体上观察成熟胚愈伤组织诱导到分化成苗的整个过程发现，满足需要的外植体数量在不断降低，而变异系数在不断增大。从单位数量成熟胚的理论成苗率看，XNCW2的再生能力最高，为27.38%；其次是鲁麦14、宝丰228和XNCW4，这三个材料的理论成苗率都在10%以上；XNSQ04、XNSQ29、XNSQ42、新麦11、徐州856、XNQX6、XN1376、陕150共8个材料的理论成苗率都在5%以上；其余材料的理论成苗率在5%以下。从单位数量愈伤组织的实际成苗率看，XNCW2同样表现最佳，为40.38%；其次是鲁麦14、宝丰228、XNCW4、徐州856、陕150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04和新麦11；这9个材料的实际成苗率在20%以上；XN1376、XNSQ31、XNQX6、XNCW3、XNQX1、XN8164、新麦13、XNCW5、汝阳2号和Q2f-4-13的成苗率在10%以上；其余材料的实际成苗率在10%以下。由此可见，无论是单位数量成熟胚的理论成苗率还是实际成苗率，XNCW2、鲁麦14、宝丰228、XNCW4、XNSQ04、XNSQ29、XNSQ42、新麦11、徐州856、XNQX6、XN1376、陕150的再生能力表现较好，可以作为小麦遗传转化的候选材料。

表1 不同基因型小麦成熟胚的出愈率、胚性愈伤率、褐化率、分化率、实际成苗率和单位数量成熟胚的理论成苗率

(续表1 Continued table 1) %

2.2 供试小麦品种(系)愈伤组织生理性状的差异分析

不同基因型小麦成熟胚愈伤组织生理性状的特征见表2。鲜重、干重和含水量的平均值分别为0.046 2 g、0.003 8 g和91.62%，变异系数分别为73.14%、77.25%和1.55%；可溶性蛋白含量和MDA含量的平均值分别为1.71 μg·g-1FW和8.50 nmol·g-1FW，变异系数分别为33.47%和38.97%；SOD活性和POD活性分别为147.12 U·g-1FW和4 940.49 U·g-1FW·min-1，变异系数分别为67.77%和28.25%。

表2 不同小麦成熟胚愈伤组织的生理特性

表3 不同小麦成熟胚再生特性及愈伤组织生理性状间的相关性分析

*和**分别表示在 0.05 和0.01水平上显著相关。

* and ** mean the correlation is significant at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.3 供试小麦品种(系)各性状的相关性

不同基因型小麦各性状的相关性分析结果见表3。单位数量成熟胚的理论成苗率与胚性愈伤率、分化率和实际成苗率极显著相关，与SOD活性显著相关。与出愈率显著相关的生理指标只有愈伤组织的含水量(显著负相关，r=-0.266)，与胚性愈伤率显著相关的生理指标有可溶性蛋白含量(显著负相关，r=-0.269)、SOD活性(显著正相关，r=0.335)和POD活性(显著正相关，r=0.267)，与实际成苗率显著相关的生理指标只有SOD活性(显著正相关，r=0.281)，没有生理指标与愈伤组织的分化率显著相关。此外，与愈伤组织褐化率显著相关的生理指标有愈伤组织的含水量(显著负相关，r=-0.281)和可溶性蛋白含量(极显著正相关，r=0.561)。由此可见，愈伤组织的含水量、可溶性蛋白含量、SOD活性和POD活性都与小麦成熟胚的再生能力有关。

3 讨 论

小麦成熟胚组织培养受到多种条件的制约，基因型差异是限制成熟胚组织培养的关键因素。本试验通过对56个小麦基因型成熟胚组织培养特征和部分生理性状进行比较，共筛选出了XNCW2、鲁麦14、宝丰228、XNCW4、徐州856、陕150、XNSQ42、XNSQ29、XNSQ04、新麦11共10个小麦高频再生基因型，实际成苗率都在20%以上，最高可达40.38%，单位数量成熟胚的理论成苗率都在5%以上，最高可达27.38%，并初步得出小麦愈伤组织中SOD酶活性降低可能是影响其再生能力的原因之一。

在小麦成熟胚的组织培养中，不同基因型的出愈率、胚性愈伤率、分化率、实际成苗率和单位数量成熟胚的理论成苗率存在极大差异，由此可见，基因型影响成熟胚脱分化至成苗的整个过程，这与Mathias等[25]和Fennell等[26]的研究结果一致。同时，我们还注意到基因型影响成熟胚组织培养的过程是复杂的。从群体水平分析，从成熟胚愈伤组织的产生到再生苗形成的过程中，出愈率、胚性愈伤率、分化率、实际成苗率和理论成苗率依次降低，而变异系数则依次增加，表明基因型对单位数量成熟胚的理论成苗率影响最大，其次是实际成苗率，最后是分化率、胚性愈伤率和出愈率；在Yin等[27]的研究中，不同小麦的出愈率同样远远高于分化率或者成苗率，且脱分化率的变异也远小于分化率和成苗率的变异，说明在组织培养后期，成熟胚的组织培养对基因型的依赖性更强，基因型对成熟胚组织培养的影响更大。此外，与Yan等[24]的研究结果相同，成熟胚的胚性愈伤率、分化率和实际成苗率呈极显著正相关，近一步说明小麦品种(系)成熟胚的脱分化与再分化是密切联系的，对大多数小麦而言，胚性愈伤率越高，再生能力越强，分化成苗率越高。但特殊的小麦基因型也值得注意，例如XNCW1和百农64，前者胚性愈伤率为39.76%，但其分化率和实际成苗率仅为7.46%，后者胚性愈伤率极低，只有5.30%，但其分化率可达48.59%，可见胚性愈伤率高的小麦其分化率不一定高。因此，不同基因型的小麦成熟胚在脱分化和再分化过程中的表现并不完全一致，基因型影响小麦成熟胚再生的过程是多变的。

目前已经有许多关于小麦高效再生基因型筛选的研究，大多以分化率或者成苗率作为筛选条件，而忽略了成熟胚的脱分化过程[13,28]。从本研究结果分析，虽然不同基因型小麦成熟胚的出愈率相对较大且变异较小，相对于分化率和成苗率对小麦最终成苗的结果影响要小，但愈伤组织基数的降低会影响胚性愈伤数目，从而影响最终成苗数，因此出愈率和胚性愈伤率在评价小麦再生能力时也是不可缺少的。此外，本研究采用了单位数量成熟胚的理论成苗率，即假设所有产生胚性愈伤组织的成熟胚都形成了理想愈伤，且愈伤数目相同，统计胚性愈伤率和实际成苗率，单位数量成熟胚的理论成苗率即为胚性愈伤率与实际成苗率的乘积，兼顾了成熟胚的脱分化能力和愈伤组织的再分化能力，同时还代表了单位数量成熟胚的理论成苗数，具有实际意义。相关分析表明，单位数量成熟胚的理论成苗率与胚性愈伤率、分化率和实际成苗率均呈极显著正相关，且使用单位数量成熟胚的理论成苗率理论上可得到最多数量的再生苗，因此单位数量成熟胚的理论成苗率可以作为成熟胚再生能力的鉴定指标。

小麦愈伤组织形成过程中伴随着一系列的生理生化变化，内源生理因素对小麦成熟胚愈伤组织的形成影响较大。本研究中，愈伤组织的可溶性蛋白含量和褐化率极显著正相关，说明愈伤组织中过高的可溶性蛋白含量不利于愈伤组织的再生和分化。SOD活性与胚性愈伤率、实际成苗率和理论成苗率呈显著正相关，说明SOD活性的上升有利于胚性愈伤组织的形成和再分化，这与Cui等[17]和Hao等[18]的研究结果相符。此外，外源物质如植物生长调节剂[27]、H2O2[17]、除草剂等[28]的添加也会影响内源生理因素从而影响愈伤组织的分化，因此，内源生理指标的变化表征愈伤组织的再生能力还有待进一步研究。

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Evaluation of Regeneration and Physiological Characteristics of Callus from Mature Embryo of Wheat

TANG Yi1, WANG Zhicheng2, CUI Guibin1, SUN Fengli1,ZHANG Chao1, LIU Shudong1, XI Yajun1

(1.College of Agronomy, Northwest A&F University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Northwestern China, Ministry of Agriculture, Yangling, Shaanxi 712100, China;2.Seed Management Department of Longxian County, Longxian, Shaanxi 721200, China)

To screen wheat genotypes for better tissue culture using mature embryo, mature embryos of 56 wheat cultivars were scraped and used as explants for regeneration capacity analysis by comparing callus rate, embryogenic callus rate, browning rate, differentiation rate, actual seedling rate, and theoretical seedling rate. The physiological characteristics of embryonic callus were also evaluated. The results showed wheat genotypes including XNCW2, Lumai 14, Baofeng 228, XNCW4, Xuzhou 856, Shaan 150, XNSQ42, XNSQ29,XNSQ04,and Xinmai 11 have high regeneration frequency with the actual seedling rate above 20% and theoretical seedling rate above 5%. The coefficient variation of callus rate, embryogenic callus rate, differentiation rate, actual seedling rate, and theoretical seedling rate were 14.94%, 73.95%, 84.89%, 109.47%, and 156.54%, respectively, which means wheat genotype plays an increasingly important role in tissue culture from dedifferentiation to seedling formation. High superoxide dismutase (SOD) activity is probably positive for embryogenic callus formation and differentiation because SOD activity of callus was significantly positive correlated with embryogenic callus rate and seedling rate. However, callus with more soluble protein has weaker regeneration ability, because soluble protein content is positively correlated with browning rate.

Wheat; Mature embryo; Regeneration; Tissue callus; Physiological characteristics

时间：2016-10-08

2016-01-24

2016-09-07

陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTZDNY01-08)；国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX080022003)

E-mail：378698952@qq.com

奚亚军(E-mail：xiyajun11@126.com)

S512.1；S336

A

1009-1041(2016)10-1307-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.012.html