饲料中4种四环素类药物的检测——高效液相色谱法

张天姝,杨慧杰，2⋆,孙世峰

(1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心,辽宁 沈阳 110000; 2.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁 沈阳 110866; 3.辽宁省沈阳市动物卫生监督所,辽宁 沈阳 110000)

饲料中4种四环素类药物的检测
——高效液相色谱法

张天姝1,杨慧杰1，2⋆,孙世峰3

(1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心,辽宁 沈阳 110000; 2.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁 沈阳 110866; 3.辽宁省沈阳市动物卫生监督所,辽宁 沈阳 110000)

本研究建立了高效液相色谱法同时测定饲料中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素4种四环素类药物。结果显示,4种药物在1～100 g/m L范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均达到0.999以上;土霉素和四环素的检出限为0.25 g/g,金霉素和强力霉素的检出限为0.5 g/g;土霉素和四环素的定量限为2 g/g,金霉素和强力霉素的定量限为4 g/g;回收率达到74.1%～98.8%。本方法适用于浓缩饲料、配合饲料、预混合饲料中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种四环素类抗生素的检测。

高效液相色谱法;土霉素;金霉素;四环素;强力霉素

四环素类抗生素是一类广谱抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很好的抑制作用,因此在养的应用,经常以亚治疗剂量添加于动物饲料中,用于预防动物疾病和促生长。长期的使用导致动物食品中该类药物的残留富集,不仅会有耐药菌株的出现［1],降低该药物的治疗效果,四环素还会与骨骼中的钙结合,抑制牙齿和骨骼的发育,引起人的荨麻疹等［2]。由此可见畜产品质量安全直接关系到人类的健康,而控制畜产品质量需从源头把关,特别是严把饲料质量关。

目前,已报道的四环素类药物检测方法主要有微生物法、薄层色谱法、酶联免疫法、分光光度计法、荧光法和色谱法［3-5],色谱法具有灵敏度高、快速等特点,已经被我国2000年版药典采用［6]。本研究以四环素类抗生素为研究对象,采用高效液相色谱法,建立了一种高效、简便、快速、灵敏的测定饲料中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备美国Waters公司2695型高效液相色谱仪(配紫外检测器);高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司生产);O asisRHLB固相萃取小柱(美国沃特世公司生产);圣德利纯水系统(重庆市澳凯龙医疗器械研究有限公司);氮吹仪(N-EVAP型,美国Organomation公司生产)。

1.2 试剂和材料土霉素对照品、四环素对照品、盐酸金霉素对照品(中国兽医药品监察所),强力霉素对照品(Dr.Ehrenstor fer公司),色谱纯甲醇(Fisher公司),色谱纯乙腈(Fisher公司),三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司),试验用水均为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 对照品的配制标准储备液的配制:称量土霉素、盐酸金霉素、盐酸四环素和强力霉素的对照品各约25 m g(精确至0.000 01 g),分别置于25 m L棕色容量瓶中,用甲醇稀释成浓度均约为1 m g/m L的溶液,作为标准储备液。

标准工作液配制:量取标准储备液适量,用甲醇稀释成含土霉素、盐酸金霉素、盐酸四环素和强力霉素浓度为10～20μg/m L的标准工作液。现用现配。

1.3.2 样品处理和提取称取5.0 g样品(精确至0.000 1 g),至于具塞锥形瓶中,加入50 mL MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液,5 mL 20%三氯乙酸溶液,震荡提取30 min,10000 r/min离心5 min,取5 m L上清液过经3 mL甲醇,3 mL水润洗的HLB固相萃取小柱。固相萃取小柱经3 mL水,3 mL 5%甲醇淋洗后,用3 mL甲醇洗脱,洗脱液经60℃氮气吹干后,用1.0 mL流动相复溶,复溶液涡旋后过0.22μm滤膜,上机测定。

1.3.3 色谱条件色谱柱:XBridgeTMC18 150 mm× 1.6 mm,粒径5μm;检测器:紫外检测器,检测波长360 nm;柱温:30℃;流动相组成及比例为草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5;流动相速度:1.0 mL/min;进样量:10～20μL。

2 结果与分析

2.1 流动相的确定

2.1.1 流动相试剂的确定本试验尝试采用乙腈-水作为系统流动相,结果样品峰型严重拖尾,分离度及对称度均不理想。相关文献记载［7]四环素类化合物多以阳离子的形式存在,可以和草酸根结合形成离子对,改善峰型,且峰型的改善程度与草酸溶液的浓度相关。本试验经过验证,采用草酸-甲醇-乙腈作为系统流动相,色谱峰分离好且峰型标准,草酸溶液浓度确定为0.01 mol/L。

2.1.2 流动相pH的选择试验表明流动相的p H变化对4种抗生素的分离度、对称性和柱效都有不同程度的影响。试验分别考察了流动相p H为1.75、2.0、3.0、4.0时色谱的系统适用性情况,结果表明流动相p H为2.0时,柱效、色谱峰分离度、峰型的对称性都最佳,因此流动相的p H确定为2.0。

2.1.3 流动相比例的选择流动相中有机相与水相的比例直接影响目标物质的出峰时间,一定范围内,有机相比例越高,出峰时间越早。对于本试验而言,结合四环素类抗生素的性质,经过多次试验选择了流动相的比例为草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5等度洗脱。

2.2 样品前处理条件的优化饲料样品组成成分多、基质复杂,其中又常含有大分子蛋白和金属离子,为了保证结果的准确性,在检测时,首先要先将大分子量蛋白及饲料中常添加的金属离子除去。常用的提纯试剂有盐酸、磷酸盐、三氯乙酸、MCI-Vaine-Na2EDTA等［8-9],本试验建立的高效液相色谱法测定饲料中的土霉素、金霉素、四环素、强力霉素的含量时,选用的提纯试剂是MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液加三氯乙酸溶液,因为相同条件下,这两种试剂的组合提取效果最好。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察取混合标准工作液进行测定,色谱图见图1,4种抗生素分离度良好,彼此无干扰。将6份空白饲料样品5.0 g,按1.3.2操作,色谱图见图2,空白基质无干扰。将一定体积的4种抗生素对照品溶液加入空白饲料样品中,按1.3.2操作,色谱图见图3,空白饲料对4种抗生素无干扰,专属性良好。

2.3.2 方法的线性范围配置标准曲线,浓度分别为1、5、10、20、50、100μg/mL,每个浓度点制备2个平行试验,用平均值绘制标准曲线。以待测物浓度为横坐标(X,μg/mL),待测物峰面积比值为纵坐标(Y),进行回归运算,求得直线回归方程。标准曲线回归方程见表1。由表1可见,在相应的浓度范围内,各因子的响应值与质量浓度呈良好的线性关系。

图1 土霉素(1)、四环素(2)、金霉素(3)、强力霉素(4)混合标准溶液色谱图Fig.1 The mixed standard solution chromatogram of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline

图2 空白饲料样品色谱图Fig.2 Blank chromatogram of the feed

图3 饲料样品添加混合标准溶液色谱图Fig.3 The mixed standard solution chromatogram of adding feed sample

2.3.3 检测限的确定以相当于基线3倍信号(S/N≥3)相应的浓度为检测限,当饲料中添加0.25μg/g土霉素和四环素,0.5μg/g金霉素和强力霉素时,信/噪(S/N)比均大于3,因此本方法土霉素和四环素检测限为0.25μg/g,金霉素和强力霉素检测限为0.5μg/g。

表1 HPLC法测定饲料中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准工作曲线的回归方程及相关系数Table1 The regression equation and correlation coefficient o f standard curve of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline in feed determined by HPLC

表2 方法的回收率及精密度(n=6)Table2 Recovery and precision of the method

2.3.4 定量限的确定以相当于基线10倍信号(S/ N≥10)相应的浓度为检测定量限,当饲料中添加2μg/g土霉素和四环素,4μg/g金霉素和强力霉素时,信/噪(S/N)比均大于10,因此本方法的土霉素和四环素定量限为2μg/g,金霉素和强力霉素定量限为4μg/g。

2.3.5 方法回收率及精密度采用标准添加法,分别向空白饲料样品中添加低、中、高3种不同浓度的混合标准储备液(添加浓度分别为20.0、50.0和100.0μg/m L),每一浓度制备6份样品分析,平均回收率在76.2%～96.8%之间,相对标准偏差均＜5%,计算结果见表2。统计结果表明此方法稳定性强,重现性好,能够满足配合饲料和浓缩饲料产品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素含量的测定。

3 结论

3.1 1 本试验建立了应用高效液相色谱法测定饲料中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素4种四环素类抗生素的联检方法。应用该方法测定,4种药物在1～100μg/m L范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均达到0.999以上;土霉素和四环素的检出限为0.25μg/g,金霉素和强力霉素的检出限为0.5μg/g;土霉素和四环素的定量限为2μg/g,金霉素和强力霉素的定量限为4μg/g;回收率达到74.1%～98.8%。

3.2 该方法适用于浓缩饲料、配合饲料、预混合饲料中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种四环素类抗生素的检测,操作简单,实用性强,为保障我国饲料质量安全进而保障食品安全提供了重要的技术支撑。

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［3]陈丽,潘文庆,马晓康.5种四环素类抗生素快速鉴别方法的建立［J].中国药师,2010,6(13):893-894.

［4]乔坤云.HPLC分析测定鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法［J].中国卫生检验杂志,2003,13(5):610.

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Simultaneous determination of 4 kinds of tetracycline in feed by high performance liquid chromatography

Zhang Tianshu1,Yang Hui jie1.2*,Sun Shifeng3
(1.Animal feed quality and safety of venterinary testing centre in Liaoning province,Liaoning Shenyang 110016; 2.College of Animal Science and Veterinary of shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 3.Shenyang Animal Health Inspection Institute,Liaoning Shenyang 110000)

A HPLC method to Simultaneous Determination of oxytetracyline,etracycline,chlortetracycline,doxycycline in Feed stuff was established.The results showed that the calibration curves of 4 tetracyclinesexhibited good l inearity in th erange 1～100μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999.The oxytetracyline and chlortetracycline detection limit was 0.25 μg/g.The etracycline and doxytetracyline detection limit was 0.5μg/g.The oxytetracyline and chlortetracycline limit of quantitation was 2μg/g.The etracycline and doxytetracyline limit of quantitation was 4μg/g.The average recovery rate reached 74.1%～98.8%.The method is applicable for detecting the content of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline in the combinative feed,concentrated feed and premixed feed.

High Performance Liquid Chromatography;Oxytetracycline;Chlorotetracycline;Tetracycline;Doxycycline殖业中被广泛用作饲料添加剂。近年来随着养殖业的不断集约化,四环素类抗生素得到了更广泛

S859.84

B

1672-9692(2016)10-0016-05

2016-09-08

张天姝(1985-),女,硕士,主要从事饲料检验工作。

杨慧杰(1986-),女,本科,主要从事饲料检验工作。