补肾健脾中药复方调节内质网蛋白GADD34、ERO1、IRE-1干预成骨细胞凋亡的机制研究

陈水昌，李　颖，卢国森

（1.广东省中西医结合医院骨科，广东肇庆506020； 2.佛山市南海区第三人民医院，广东佛山528244）

补肾健脾中药复方调节内质网蛋白GADD34、ERO1、IRE-1干预成骨细胞凋亡的机制研究

陈水昌1，李颖1，卢国森2

（1.广东省中西医结合医院骨科，广东肇庆506020； 2.佛山市南海区第三人民医院，广东佛山528244）

●“实验”虽然是现代科学研究常用的方法，然在我国却自古有之。古代学者王冲说“等类众多，行事比肩，略举较著，以定实验也”，颜之推说“昔在江南，不信有千人帐，及来河北，不信有二万斛船，皆实验也”，大凡此义均与现代科学意义上的experiment相通。照此，传统中医药学并非只是经验之学，而更充满实验的思想和方法。实验中医药学，将现代实验科学的方法和传统中医药学的实验方法融合起来，开拓现代实验生物学、医学和药物科学的新领域。

目的：探讨补肾健脾中药复方对细胞凋亡过程中非折叠蛋白反应的作用机制。方法：将新西兰大白兔9只随机分为中药组、西药组、空白组，每组3只。中药组、西药组分别用中药复方提取液、雌二醇混悬液灌胃，空白组以同等量的蒸馏水灌胃，1个月后制备含药血浆。选用1 d龄SD大鼠获取原代的成骨细胞体外培养，中药组、西药组分别给予对应的含药血浆培养，正常空白组以及凋亡空白组给予空白组血浆培养。24 h后分别检测GADD34、ERO1、IRE-1等凋亡蛋白的光密度值（OD）。结果：与凋亡空白组相比，中药组、西药组GADD34、ERO1蛋白表达降低，差异有统计学意义（P< 0.05）。西药组比中药组更能显著降低ERO1蛋白的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：补肾健脾中药复方有可能通过非折叠蛋白反应介导的细胞凋亡途径对成骨细胞进行调控，并能在一定程度上抑制细胞的凋亡。

骨质疏松症；中药复方；GADD34；ERO1；IRE-1

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是老年常见病、多发病，患者诊出率、就诊率低，但骨折的风险系数高，在全世界范围内均有较高的发病率［1-2］。对骨质疏松症的发病机制尚未明确，目前研究大多集中于细胞水平，对亚细胞水平的作用靶点研究较少［3-5］。尽管中医中药在防治骨质疏松症方面的研究较多，但其作用机理目前尚未清楚，局限了中医药在世界的推广和应用。本项目通过补肾健脾中药复方对体外培养的成骨细胞内质网应激反应的调控作用，探讨补肾健脾中药复方对细胞凋亡过程中非折叠蛋白反应的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料

补肾健脾中药复方由淫羊藿、补骨脂、丹参、黄芪等10味中药组成，该方所含生药量为1.43 kg/L，由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供。戊酸雌二醇片，由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供（国药准字J20080036，批号：177A12）。培养细胞用1 d龄SPF级健康雌性SD大鼠20只，制备药物血浆用新西兰大白兔9只，体质量（2～2.2）kg，实验动物由广州中医药大学动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1含药血浆的制备［6-7］新西兰大白兔9只，随机分为中药组、西药组、空白组，每组3只。中药组的浓度为1.096 g/kg，西药组的浓度为0.038 mg/kg，空白组以同等量蒸馏水灌胃，灌胃给药容积为10 mL/kg。大白兔连续灌胃1 w，最后1次灌胃后2 h行心脏采血，将获得的全血置于含抗凝剂的试管中，5～10 min后3 000 r/min离心15 min，吸取上清，灭活，抽滤除菌，置-20℃保存备用。

1.2.2成骨细胞的培养［8-9］1 d龄SD大鼠，75%酒精浸泡15 min，取出头盖骨，剔净附着软组织，0.25%胰蛋白酶预消化，0.1%Ⅱ型胶原酶消化。离心，获取细胞，PBS液冲洗，置含10%NCS-MEM培养液中，37℃、5%CO2中静置培养，每2 d更换培养液1次。弃去原培养液，加入含10%的胎牛血浆MEM进行培养，培养4～7 d，单层细胞铺满培养瓶底。传代时，弃去原培养液，用D-Hank′s液冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，弃去消化液，加入培养液，吹打培养瓶底，使细胞脱落，制成细胞悬液，接种于新的培养瓶，37℃、5%CO2中静置培养。

1.2.3诱导细胞凋亡［10-11］采用紫外线诱导细胞凋亡，紫外线照射成骨细胞10 min，照射过程中以0.5 mL D-Hanks液湿润皿底。照射后中药组和西药组分别给予对应的含药血浆培养，凋亡空白组和正常空白组均给予常规血浆培养。24 h后，收集成骨细胞做下一步实验。正常空白组不用紫外线照射。

1.2.4线粒体提取及蛋白质测定［12-13］采用细胞匀浆法对细胞分离线粒体。使细胞生长铺满整个培养表面，分别加入PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面。然后抽去，再加入胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面，置入37℃培养箱，经离心、涡旋震荡，移出上清液后，保留沉淀颗粒以获得线粒体沉淀物。再重复上述步骤，以获得高纯线粒体样品，最后置-70℃冰箱保存备用。将线粒体沉淀，加入适量裂解液，室温放置5 min，其间不断涡旋搅动，12 000 rpm离心弃去不溶物，吸取上清液，即为蛋白质样品溶液。采用检测蛋白质光密度（OD值）的方法分别检测GADD34、ERO1、IRE-1等凋亡蛋白含量。

2　结果

2.1成骨细胞凋亡率与细胞周期变化

与正常空白组相比，中药组、西药组、凋亡空白组G0/G1期、G2M期细胞增多，S期细胞明显减少，凋亡百分率显著增高（P＜0.05）。结果见表1。

表1　紫外线对成骨细胞凋亡与细胞周期的影响　（±s）

表1　紫外线对成骨细胞凋亡与细胞周期的影响　（±s）

注：与正常空白组比较，1）P＜0.05

组别　G0/G1　S　G2/M　凋亡率（%）正常空白组 39.335±1.789　53.987±2.970　6.673±1.383　3.728±0.830凋亡空白组 44.181±1.9591）46.835±1.3961）　8.986±1.7751）10.150±0.8381）西药组　45.792±2.2511）41.069±2.7311）13.140±1.4271）　7.745±0.9621）中药组　45.596±2.3281）43.528±2.9811）10.880±1.2701）　8.284±0.5411）

2.2蛋白表达的变化

蛋白质光密度值（OD值）检测显示，正常空白组有少量凋亡蛋白表达，凋亡空白组蛋白表达水平最高。与凋亡空白组相比，中药组、西药组GADD34、ERO1降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；IRE-1亦降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。西药组比中药组更能显著降低ERO1蛋白的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　各组中蛋白表达的OD值　（±s）

表2　各组中蛋白表达的OD值　（±s）

注：与凋亡空白组比较，1）P＜0.05；与中药组比较，2）P＜0.05

组别　GADD34　ERO1　IRE-1正常空白组　0.623±0.074　0.640±0.102　0.665±0.056凋亡空白组　1.428±0.150　1.351±0.191　1.341±0.131中药组　1.132±0.2391）　1.216±0.2341）　1.234±0.126西药组　1.238±0.0971）　0.983±0.1101）2）　1.278±0.097

3　讨论

目前研究表明，非折叠蛋白反应介导的细胞凋亡有以下3条主要的途径：CHOP/GADD153途径、Caspases-12途径及ASK1/JNK途径［14-15］。GADD34作为一种细胞周期蛋白，在特定情况下，如内质网功能障碍、DNA损害和细胞周期停滞时表达上调，一些在脑缺血动物模型中的研究提示GADD34蛋白与细胞凋亡有关。所以GADD34是内质网应激（ERS）后蛋白质合成功能恢复的关键性分子。

ERO1主要参与维持ERS内氧化状态。ERO1参与氧化二硫键异构酶，维持蛋白折叠过程持续进行。ERO1在形成二硫键的过程中可产生H2O2，因此ERO1激活是细胞内活性氧簇（ROS）产生的重要来源之一。过多的ROS产生，超过细胞抗氧化防御能力就会影响细胞内氧化还原稳态，引起氧化应激和ERS等过程。

IRE-1介导的XBP1剪接诱导的未折叠蛋白反应能促进细胞的生存，IRE-1的过表达会促进人胚肾细胞HEK193的凋亡。激活的IRE-1，其胞浆的酶结构域连接接头分子TRAF2，与ASK1共同形成IRE1-TRAF2-ASK1复合物，从而激活JNK。活化后的JNK可从细胞质转移到细胞核中，通过磷酸化激活c-jun、c-Fos、EIK-1等转录因子而调节下游凋亡相关靶基因的表达［16］。

在本实验中，凋亡空白组中GADD34、ERO1、 IRE-1表达较正常空白组明显升高，说明在紫外线诱导成骨细胞的凋亡过程中，GADD34、ERO1、IRE-1参与的CHOP/GADD153途径、ASK/JNK途径激活，从而促使细胞凋亡发生［17-18］。

在中医学中，骨质疏松症属“骨痿”范畴，根据肾主骨的理论，其病因病机当首责各种原因导致肾（气、阴、阳）的不足，影响骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充养，易发生骨骼脆弱无力，即骨质疏松性骨折。补肾健脾中药复方有补肾壮骨、健脾益气、活血化瘀之功效，方中以补骨脂补肾助阳壮骨为君药，肉苁蓉、淫羊藿、菟丝子加强补肾阳之功为臣药，佐以黄芪补中益气，丹参、当归活血化瘀，熟地、白芍滋阴益精。通过对数据结果的分析，中药组和西药组均可以降低GADD34、ERO1蛋白的表达水平，与凋亡空白组相比差异有统计学意义（P<0.05）。因此，我们可以认为，在降低或者阻断细胞凋亡途径方面，中药复方在一定的程度上可以达到与雌二醇相同的效果，这对于阐释和推广中药复方治疗骨质疏松症具有重要的意义。

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（编辑：张世霞）

Mechanism of Bushen Jianpi compound on osteoblasts apoptosis by regulating endoplasmic reticulum proteins GADD34，ERO1 and IRE-1

Chen Shuichang1，Li Ying1，Lu Guosen2
（1.Department of Orthopaedics，Guangdong Province Integrative Medicine Hospital，Zhaoqing Guangdong 506020；2.Third people′s Hospital of Nanhai，Foshan Guangdong，528244）

Objective：To explore the mechanism of Bushen Jianpi compound on inhibition of osteoblasts apoptosis by regulating unfolded protein.Methods：9 New Zealand rabbits were randomly divided into the Chinese medicine group（Bushen Jianpi compound group），the western medicine group（estradiol group）and blank group.A month after administration，serum containing medicine was prepared in each groups.1day old SD rats were used to culture primary generation osteoblasts. Osteoblasts were divided into the Chinese medicine group，the western medicine group，apoptosis blank group and blank group.24 h after culture，expressions of GADD34、ERO1 and IRE-1 were examined.Results：Compared with the apoptosis blank group，the expression levels of GADD34 and ERO1 in serum of the Chinese medicine group and the western medicine group were decreased obviously（P<0.05）.Compared with the Chinese medicine group，expression level of ERO1 was decreased obviously in western medicine group（P<0.05）.Conclusion：Bushen Jianpi compound maybe regulate and control osteoblasts through apoptosis pathway mediated by unfolded protein，and inhibit osteoblasts apoptosis by regulating expressions of GADD34、ERO1、IRE-1 to some extent.

osteoporosis；Chinese herbal compound；GADD34；ERO1；IRE-1

R285

A

1671-0258（2016）05-0017-03

广东省科技计划项项目（2013B021800162）；佛山医学类科技攻关项目（201308180）

陈水昌，副主任医师，E-mail：nhqtcm@163.com