两种不同方法学检测精子DNA完整性分析的结果评价

郝栩婷

（首都医科大学附属北京妇产医院检验科，北京 100006）

两种不同方法学检测精子DNA完整性分析的结果评价

郝栩婷

（首都医科大学附属北京妇产医院检验科，北京 100006）

精子； DNA完整性； 方法学评价

近年来，不孕不育问题已经成为世界性医学和社会问题，约有10%～15%的育龄夫妇受到不孕不育的困扰。其中男方因素约占50%（约20%为男方单方因素，30%～40%为男女双方因素），全世界不孕不育发病率有逐渐上升趋势［1］。目前国内评价男性生育功能的指标主要还是精液常规参数分析。然而，传统的精液常规检测项目尚不能准确、完全地反映精子质量情况。有学者研究认为，男性不育者中仍有15%的精液常规分析是正常的，并且30%以上的男性不育患者因病因不清而被诊断为特发性不育［2］。精子 DNA是遗传物质的携带者，成熟的精子，其DNA链紧密缠绕着鱼精蛋白，使精子染色质高度紧密完整。当精子受外部应激状态（如氧化应激反应、温度升高等）刺激，就可能损伤精子DNA，从而导致精子DNA完整性受损。精子DNA完整性分析（DFI）检测作为评价精子DNA损伤的指标逐渐成为男性不育临床检测的新选择，越来越受到临床医生的重视。但是，目前DFI检测的方法学有很多种，且没有统一的标准，各实验间的检测结果是否能够通用还需要进一步研究。目前国内检测 DFI主要有精子染色质扩散实验（SCD）法和末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）两种，本文针对这两种方法进行比对研究，旨在探讨这两种方法学结果的可比性。

材料和方法

1 研究对象

选择2014年10月至2014年12月在我院不孕不育门诊就诊的80例男性患者作为研究对象，年龄28～52岁，身体健康，无睾丸外伤、家族遗传性疾病史及性功能障碍病史，体检无明显异常。所有研究对象取精前禁欲3～7d，手淫法采集精液于干燥无菌取精杯中，立即送检。

2 仪器及试剂

SCD法仪器使用日本奥林帕斯 CX-21显微镜，试剂使用西班牙Halosperm＠试剂盒；TUNEL法采用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪，试剂由浙江星博生物公司提供。

3 方法

3.1 重复性实验（批内精密度） 选取同一份样本，用两种不同方法同时检测20次，计算均值、标准差s、变异系数 CV。

3.2 两种方法的检测结果比较 所有样本均同时使用两种方法进行检测，并将记录数据进行比较；以DFI结果30%为临界值［3］，分别计算各自的阳性率并进行分析。

4 统计学分析

结 果

（1）重复性实验结果见表1。由表1可见，使用TUNEL法检测结果的重复性要优于SCD法。

表1 两种方法检测的精密度比较（%）

（2）两种方法学检测结果见表2。两组检测结果差异具有统计学意义（P＜0.05），阳性率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两种方法的检测结果比较

（3）两种方法学检测结果一致性见表3。kappa＝0.70，两种方法学的一致性不理想。

表3 两种方法结果的一致性比较

讨 论

从上述实验数据中能看出，TUNEL法检测结果的精密度要明显优于 SCD法。这可能是两者实验方法导致的。目前采用 SCD法检测 DFI尚无自动化仪器操作，只能以手工法进行计数，结果的判断受到人为的主观因素影响较大；另外受人力的限制，一次实验只在镜下观测五百个精子，结果有一定的片面性。而TUNEL法通过全自动流式细胞仪检测，结果的判断全部由仪器进行，一次实验能观测近万个精子，结果的代表性好，所以 TUNEL法检测的精密度要优于SCD法。

两组结果之间的相关性不理想，且两组检测结果之间差异较大，具有统计学意义（P＜0.05），且两种方法的一致性也不理想。这可能是因为二者检测原理不同导致的。TUNEL法检测原理是在保持细胞结构的前提下，通过末端脱氧核苷酸转移酶（dUTP）将荧光标记物与 DNA断裂片段末端的游离氢氧根结合，通过流式细胞仪直接测定精子DNA单链和双链的数量；而SCD法检测原理是通过检测精子 DNA对酸变性的易感性间接反映精子DNA的完整性，即将液化后的精液与琼脂糖混合铺于载玻片上，酸变性和除去核蛋白后，经染色后在显微镜下观察，用有DNA碎片的精子不能产生特征性的光晕的特性来判读结果［4］。

两种方法学检测的阳性率结果，SCD法略高于TUNEL法，但差异无统计学意义（P＞0.05）。有研究显示［5］，SCD法检测结果较TUNEL法检测结果更敏感，这点可能是本次实验样本量较少有关。

综上所述，这两种方法均能反应出精子 DNA的完整性。由于二者实验方法及检测原理的不同，检测结果目前尚不同通用。

检测精子 DNA完整性的方法还有很多，每种方法的检测原理及实验方法都不一样，各种方法也缺乏标准化及检测标准值［6］。如果实验室同时使用两种不同方法进行检测，有可能会出现同一患者不同的检测结果。因此建议不要同时使用两种方法进行检测，临床实验室应根据自身的情况选择一种适合本实验室的检测方法。

［1］李佳祥，舒金辉，李劲，等.精子DNA完整性检测在男性不育诊断中的应用价值.中国男科学杂志，2012，26（9）：15-23.

［2］孙静波，姜宏，何瑞冰.精子DNA完整性与精液参数的相关性研究.中国男科学杂志，2010，24（4）：26-29.

［3］黄学锋，金建远，费前进，等.精子 DNA损伤：独立的精子质量评价指标.温州医学院学报，2010，40（3）：239-242.

［4］杨译，姜辉，张海娇，等.男性不育患者年龄与精子DNA碎片和精液常规参数的相关性分析.中国性科学，2012，21（2）：17-19.

［5］Zhang L H，Qiu Y，Wang K H，et al.Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy：comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nick-end labeling assay.Fertil Steril，2010，94（3）：1027-1032.

［6］孙烁磊.精子DNA损伤的机制及检测方法研究进展.国际泌尿系统杂志，2008，28（4）：480-483.

（张增武编辑）

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.035

2015-09-08；

2015-10-28

郝栩婷，主管检验师。Tel：13501039505；E-mail：13501039505＠163.com