HBV基因分型检测试剂性能评估研究要点

吴传松，李耀华

（国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京，100044）

HBV基因分型检测试剂性能评估研究要点

吴传松，李耀华

（国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京，100044）

依据《体外诊断试剂注册管理办法》和乙型肝炎病毒核酸分型试剂自身特点，提出对 HBV基因分型检测试剂性能研究的特殊要求。对该类试剂的参考品和质控品研制、阳性／阴性参考品符合率、最低检测限、分析特异性、精密度、基因混合型研究、携带污染率等方面进行了详细解析。阐述了乙型肝炎病毒基因分型类体外诊断试剂的性能研究要点。为从事该类产品注册申报前性能研究的行业人员提供参考。

HBV基因型； 性能研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因型分型检测试剂是指利用包括分子生物学相关方法在内的核酸检测技术，以 HBV基因序列为检测靶标，对人血清、血浆等样本中的HBV不同基因型进行体外定性检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，乙型肝炎病毒基因型分型可作为乙型肝炎感染者临床诊疗的辅助指标之一。由于不同的乙型肝炎病毒基因型对现有药物治疗可能存在不同的治疗响应，乙型肝炎病毒分型基因检测在慢性乙型肝炎患者治疗中的作用正被越来越多人所关注［1］。检测试剂的性能优劣直接影响检测结果是否能够有效反映临床样本的真实状态，检测试剂性能也是反映产品主要原材料选择、生产工艺及反应体系等多方面因素是否合理的客观评价指标。检测试剂性能研究应作为研究者在研制产品时的重点关注环节，并应在产品生产和使用过程中不断研究并改进，以期在临床应用时，减少产品检测过程中可能出现的假阴性和假阳性［2］，避免因检测结果错误造成患者延误治疗或治疗方案制定不当。检测试剂性能的研究方案应结合产品的反应原理、临床用途、使用条件等综合因素进行设计。产品性能评估应涵盖研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料［3］。本文主要针对目前用核酸扩增反应原理的乙型肝炎基因型分型试剂盒在申请上市前进行性能研究的过程中，应注意的常见问题进行阐述。

1 产品分析性能

1.1 最低检测限

对不同 HBV基因型进行系列稀释，通过对不同系列稀释样本检测结果进行统计后，选取95%（n≥20）检出率水平作为最低检出限确定标准。申报试剂时，对说明书描述的所有基因型应在病毒浓度最低检出限或接近最低检出限的条件下进行验证。

1.2 分析特异性

1.2.1 交叉反应 用于 HBV基因分型检测试剂交叉反应验证的病原体种类，主要考虑与 HBV基因分型核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体，以及不同基因型之间、乙型肝炎病毒其他基因型对被检测基因型的影响。对于难以获得的基因型，可采用针对该基因型构建的相同靶基因序列质粒进行交叉验证。建议用高浓度的病原体对乙型肝炎病毒核酸阴性样本进行交叉反应的验证。研究者还应将所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属／型别和浓度确认方法等因素纳入分析特异性研究方案。

1.2.2 干扰物质 影响该类检测试剂的潜在干扰物质主要包括内源性干扰物质和外源性干扰物质。内源性干扰物质是指样本中常见的影响检测结果的物质，如血红蛋白、甘油三酯、胆红素等；外源性干扰物质是指影响检测结果的常用抗凝剂、常用抗病毒药物、干扰素、保肝治疗药物，如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等。在评价干扰物质对该类试剂性能影响时，建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测。干扰物浓度的范围应覆盖人体生理及病理状态下可能出现的物质浓度。应注明不同干扰物质对被检测物质无干扰的最高限值。对于不易收集的干扰物质样本，可使用临床模拟样本进行调节［4］。

1.3 精密度

精密度具体实验方法可以参考相关国外或国内有关体外诊断产品性能评估文件进行。研究者应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价，用于评价的样本浓度至少应包含阴性、弱阳性和强阳性三个水平。同时，应设置合理的精密度评价周期方案。申请人还应选择不同环境的实验室进行重复实验，以对室间精密度进行评价。

1.4 阳性／阴性参考品符合率

所有基因型别的阳性参考品均应按要求检出阳性。考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应PCR循环阈值（Ct值）的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下其结果均应为阴性。

2 企业内部校准品及质控品的建立

2.1 内部参考品及试剂内对照（质控品）

由于乙型肝炎病毒不易培养，制备相应的参考品及质控品时，建议采用灭活病毒的血清／血浆。参考品及质控品的检测方法应与被测临床样本的检测方法一致。同时，在不同级参考品及质控品体系建立过程中，应具备完成的溯源链体系。

企业内部参考品以及质控品的设置必须客观合理，能够充分评价产品的质量。应采用核酸测序方法或其他方法对企业内部参考品以及质控品中的物质成分进行确认。

2.2 阳性参考品及阳性质控品

阳性参考品应包含试剂盒所能检测的所有基因型（所有的单基因型以及所有的重组基因型），每个基因型应设置不同浓度水平。为满足验证产品性能的需要，至少应设置两个浓度水平（弱阳性、中或强阳性）。常见基因型（如B型、C型）阳性参考品设置建议采用灭活病毒的血清／血浆；其他基因型阳性参考品设置可采用模拟临床样本。对于阳性参考品的获取方式，建议使用核酸测序方法或者其他能证明问题的方法进行确认。

阳性质控品应包含目标靶基因，用于监控整个检测过程。阳性质控品作为单独检测过程，目的是模拟患者样本，用于与患者样本进行同时检测。

2.3 阴性参考品及阴性质控品

可采用经确认无目标靶基因序列的样本。阴性参考品及阴性质控品用于反映非特异扩增或检测过程，当不存在目标序列时不应有相关信号。阴性参考品设置建议采用灭活的血清／血浆。阴性质控品应参与样本核酸的平行提取，对假阳性结果进行质量控制。

2.4 灵敏度参考品（检测限参考品）

灵敏度参考品是评价产品检测能力的重要工具，对于定性产品来说，其设计的合理性显得非常重要。在基因型设置方面，应包括试剂盒所包含的所有基因型；在浓度设置方面，应采用核酸定量的方法对该参考品进行定量检测，明确被测物的具体量值，设置浓度应接近产品最低检出限。

2.5 精密度参考品

精密度参考品应反映产品检测的重复性以及重复检测的稳定性。该部分参考品应采用临床样本作为精密度参考品，需包括阴性、弱阳性、中或强阳性三个浓度水平的精密度验证。

2.6 内对照（内标）

与目标靶基因平行提取、扩增，用于对检测管内抑制物造成的假阴性结果进行质量控制。内对照（内标）可采用竞争性或非竞争性的引物设置［5］。

2.7 其他需要注意问题

如单个产品的检验原理为两种方法学或多种方法学联合检测，应对产品中每种方法学均设置参考品及质控品，用于对不同种方法学的质量监控，例如：检测原理为 PCR-杂交方法联用，在这种情况下，不仅需在PCR环节设置参考品及质控品对扩增过程进行质量控制，同时在基因探针杂交环节也必须设置质控程序对杂交过程进行质量控制。

3 其他

3.1 基因混合型的研究

该部分研究主要包括两个目的：第一是研究申报试剂检测不同浓度混合型的能力，申请人应设置不同浓度比例的混合型进行验证；第二是研究申报试剂在判读结果时，是否能够有效的区分基因重组型和基因混合型，申请人应设置不同浓度的基因重组型与不同混合比例的基因混合型进行验证。

因理想的不同浓度比例基因混合型样本在临床单位中难以收集，申报人可以使用临床模拟样本进行验证。建议该部分样本用核酸测序明确样本中包含的所有基因型序列，同时应使用核酸定量的方法确定不同基因型的浓度。如申报产品的结果判读无法有效区分基因混合型与基因重组型，应在产品说明书中进行注明。

3.2 HBV核酸分离纯化

病毒DNA提取的主要目的是富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除 PCR抑制物，这是决定PCR成败的重要因素之一。研究者都应对核酸提取的环节做详细的验证。

3.3 交叉污染和携带污染研究

该类产品是用于检测乙型肝炎病毒感染人群。在临床检测中发现，部分临床样本会出现高浓度的乙型肝炎病毒载量。这部分临床样本在提取过程中会增加交叉污染及携带污染的可能性。在核酸提取过程中，阴性样本可能因为被强阳性样本污染，导致最终检测结果为假阳性。

如采用自动提取设备提取 DNA，在携带污染试验中，建议将高浓度阳性样本与阴性样本在同一待提取反应板中连续交替排列，并应进行多轮上述提取研究。建议试验使用的高阳性样本水平调整在接近该产品检测能力的上限，将邻近高阳性样本的阴性样本的检测结果与未邻近高阳性样本的阴性样本的检测结果比较，以评估携带和交叉污染对检测结果造成的影响。

［1］刘锡光，白东亭，贾继东.乙型肝炎和丙型肝炎实验诊断与致癌机制.北京：人民卫生出版社，2011：170-190.

［2］徐伟文.体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估.分子诊断与治疗杂志，2010，3（2）：140-144.

［3］吕允凤.乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂性能评价要点.中国药事，2013.9（10）：1072-1074.

［4］FDA.Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens［EB／OL］.（2005-12-08）［2012-08-10］http：／／www.fda.gov／cdrh／oivd／guidance／1560.html

［5］李金明.实时荧光PCR技术.北京：人民军医出版社，2007：190-199.

（张增武编辑）

Registration Performance Evaluation Requirement for the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent

WU Chuan-song，LI Yao-hua
（Center for Medical Devices Evaluation of CFDA，Beijing 100044，China）

In accordance with IVD Registration Regulation and the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent’s own characteristics，the special requirements for the product performance evaluation were analyzed.Detailed analysis such reagents reference materials and quality control materials，positive／negative reference product compliance rate，the lowest sensitivity，analytical specificity，precision，hybrid genetic research and carry-over study were carried out.The main points of product performance of the hepatitis B virus genotype detection reagents were discussed.The results provided the reference information for the relevant personnel conducting performance evaluation study before submitting the registration application.

Hepatitis B Virus Genotype； Performance evaluation

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.033

2015-03-03；

2015-05-18

吴传松，男，硕士，助理研究员，从事医疗器械技术审评。