ING5在对顺铂不同敏感性的卵巢癌细胞中的表达及其影响

孙正伟，马 蓉，万 安，徐汉杰，王慧妍，周 颖,赵卫东



ING5在对顺铂不同敏感性的卵巢癌细胞中的表达及其影响

孙正伟1,2，马 蓉1,2，万 安1，徐汉杰1，王慧妍2，周 颖1,赵卫东1,2

目的 探讨在对顺铂不同敏感性的卵巢癌细胞中生长抑制蛋白5(ING5)的表达情况及其影响。方法 应用MTT法分析卵巢癌细胞系A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2对顺铂的敏感性差异并测定半数抑制浓度(IC50)值；Western blot法检测ING5蛋白在卵巢癌细胞系A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2中的表达水平；并在A2780细胞中应用ING5 siRNA沉默ING5基因，Western blot法检测沉默效率，MTT法检测转染后A2780细胞对顺铂敏感性的改变。结果 A2780细胞对顺铂的敏感性最高，IC50值为(0.423±0.020) μg/ml；而ES-2细胞对顺铂的敏感性最低，IC50值为(5.280±0.309)μg/ml(P<0.01)。然而，ING5蛋白在A2780细胞中表达最高，在ES-2细胞中表达最低(P<0.01)。ING5 siRNA显著降低A2780细胞对顺铂的敏感性(P<0.01)。结论 ING5的高表达可能有利于提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

卵巢癌细胞；顺铂；耐药；生长抑制蛋白5

卵巢癌是妇科癌症死亡的主要原因,主要由于卵巢癌早期难以诊断和在化疗过程中逐渐形成的化疗耐受。标准治疗为肿瘤减灭术和术后以铂类为第一线的化疗。尽管治疗后初期有效率较高，但频繁复发和逐渐获得的化疗耐受最终导致治疗失败。因此，卵巢癌患者5年总体生存率只有约30%[1]。化疗耐受成为成功治疗卵巢癌的主要障碍，尤其是铂类耐药。研究卵巢癌耐药的分子机制是提高卵巢癌治疗效果的重要举措。有研究[2]表明，在体内生长抑制蛋白5(inhibitor of growth protein 5,ING5)能够和p300、p53相互作用，在结直肠癌细胞中，其过表达能够诱导细胞凋亡。目前有关ING5的功能研究很少，该研究通过Western blot法检测卵巢癌细胞系中ING5的表达，探讨ING5在卵巢癌细胞系中的表达与对顺铂诱导细胞凋亡敏感性之间的关系及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人卵巢癌细胞系ES-2、HO8910、SKOV-3购自中国科学院上海细胞库；A2780细胞系购自北京协和肿瘤细胞库。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)、RPMI Medium-1640、DMEM、McCoy’s 5A(美国Gibco公司)；MTT(美国Sigma公司)；兔抗人ING5单克隆抗体、小鼠抗人GAPDH抗体、HRP标记山羊抗鼠/兔抗体(美国Abgent公司)；增强化学发光剂(ECL)A液、B液(美国Pierce公司)；ING5 siRNA(广州锐博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人卵巢癌细胞系ES-2、SKOV-3用含有10%FBS的McCoy’s 5A培养基培养，HO8910细胞系用含有10%FBS的DMEM培养基培养，A2780细胞系用含有10%FBS的RPMI Medium-1640培养基培养，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

1.2.2 Western blot法检测蛋白表达 贴壁的细胞用冰冷的PBS冲洗3次后，收集细胞入EP管中，重悬，加入1×蛋白裂解液。将蛋白样品调整浓度后等量加入12%的SDS-聚丙烯凝胶电泳分离。在TanonEPS200电转系统进行转膜，将样品蛋白电转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h。孵育一抗、二抗。然后转入暗室加ECL发光液，曝光显影，扫描灰度值。

1.2.3 MTT法检测顺铂IC50值 取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后接种于96孔板中。待细胞贴壁后，分别给予所确定的5个梯度浓度(0.032、0.16、0.8、4、20 μg/ml)的顺铂处理。孵育72 h后，每孔加入5 mg/ml 15 μl MTT 试剂，在培养箱内继续孵育4 h。去除培养基，加入150 μl DMSO溶解甲瓒，摇床轻轻摇晃10 min，完全溶解甲瓒。使用酶标仪于570 nm波长测吸光度(optical density,OD)值。通过Msvbvm50软件计算使细胞抑制率为50%时的顺铂浓度。实验重复3次。

1.2.4 siRNA瞬时转染 转染的前1 d，根据实验要求准备细胞、双无培养基。用不含血清的配套培养基稀释Lipofectamine 2000,轻轻混合，室温孵育5 min。用不含血清的培养基稀释ING5 siRNA,轻轻混合，阴性对照(negative control,NC)用无关序列寡聚物。稀释好的Lipofectamine 2000经过5 min孵育后，分别与上述ING5 siRNA及NC轻轻混和，室温静置20 min以形成核酸-Lipo2000混合物。将核酸-Lipo2000混合物加入含有细胞和培养液的细胞培养板中，轻轻使之混合均匀。置37 ℃、5% CO2培养箱中，6 h后除去转染试剂，加完全培养基培养至检测时间，实验重复3次。

2 结果

2.1 MTT法检测ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780细胞系对顺铂的IC50值 A2780细胞对顺铂的IC50值最低为(0.423±0.020) μg/ml，其次是SKOV-3(0.833±0.028)μg/ml、HO8910(1.737±0.032)μg/ml，对顺铂的IC50值最高的是ES-2细胞为(5.280±0.309)μg/ml，大约是A2780细胞IC50值的12.48倍。与A2780细胞IC50值比较，差异均有统计学意义(F=199.9,P<0.01)。

2.2 ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780细胞系中的表达 A2780细胞ING5蛋白表达最高，其次是HO8910、SKOV-3，而ES-2细胞ING5蛋白表达最低，明显低于A2780细胞。与A2780细胞ING5蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(F=367.7,P<0.01)。见图1。

2.3 ING5 siRNA降低了A2780细胞系对顺铂的敏感性 分别在A2780细胞中转染ING5 siRNA和NC, Western blot法检测ING5蛋白的表达，与NC相比，转染ING5 siRNA组中ING5蛋白的表达明显下调(t=9.151,P<0.01)。见图2。MTT法检测转染ING5 siRNA和NC后A2780细胞对顺铂敏感性的变化，结果表明，与NC(IC50：1.020±0.187 μg/ml)相比，转染ING5 siRNA后，A2780细胞对顺铂的敏感性(IC50：7.057±0.207 μg/ml)显著下调(t=37.030,P<0.01)。

图1 Western blot法检测ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780细胞系中的表达与A2780比较：**P<0.01

图2 Western blot法检测ING5蛋白在转染ING5-NC、ING5-siRNA的A2780细胞系中的表达与ING5-NC组比较：**P<0.01

3 讨论

卵巢癌是所有妇科肿瘤中死亡率最高的，因为其通常只有在晚期才能得到确诊，并且患者的预后取决于其对化疗药物的敏感性。然而，原发或者逐渐获得的化疗耐受，特别是对铂类耐受限制了治疗的效果。虽然药物抗性的发展过程似乎是多因素的，但药物抗性的获得主要是由于细胞凋亡的失活，这也通常被认为是肿瘤的标志之一。这表明重新激活凋亡反应可能是对抗化疗耐受的有效方法[3-4]。从酵母菌到人类，生长抑制蛋白(inhibitor of growth protein,ING)在进化上都是高度保守的同源蛋白[5]。5个不同的ING基因座分布于小鼠和人类的整个基因组中[6]。其中ING5基因是Ⅱ型抑癌基因ING家族的5个不同成员之一[7]。ING5蛋白含有一个同源结构域，其是ING蛋白家族的一个高度保守的区域，该区域与染色质重塑激活有关[7-8]。Doyon et al[9]证明ING5的同源结构域能够促进局部组蛋白乙酰转移酶的激活，刺激染色质重塑以及调节基因的表达。Shiseki et al[2]发现在结直肠癌细胞中过表达ING5导致细胞集落形成减少，S期比例下降以及凋亡增加。最近的研究[10]显示在口腔鳞状细胞癌中ING5 mRNA发生突变和下调，表明其是一种抑癌基因。

本研究通过MTT法检测ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780卵巢癌细胞系对顺铂的相对IC50值，发现对顺铂的IC50值由低到高的顺序为A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2，并且ES-2的IC50值大约为A2780的12.48倍。进一步通过Western blot检测ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780细胞系中的表达情况，结果ING5的表达由高到底的顺序为A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2。结果显示高表达ING5的A2780细胞对顺铂最敏感，于是通过在A2780细胞中转染ING5 siRNA及NC并分别检测对顺铂的IC50值，与NC相比，转染ING5 siRNA后，A2780细胞对顺铂的耐受性明显升高，差异有统计学意义。而最近的研究[11]表明，ING5在多药敏感的膀胱癌细胞系5637中高表达，在多药耐受的膀胱癌细胞系H-bc中低表达。在5637中沉默ING5后导致其敏感性降低，而在H-bc中过表达ING5后使其敏感性提高。本研究结论与其相类似。有研究[11]显示，ING5在膀胱癌细胞系中是miR-193a-3p的直接下游靶点，并且参与DNA损伤反应信号通路的调节。ING5在卵巢癌细胞系中的调节机制和参与的信号通路有待进一步研究。故针对本研究的不足之处，下一步的研究重点是在低表达ING5蛋白的卵巢癌细胞系中过表达ING5后检测其对顺铂耐药性的影响，同时，寻找在卵巢癌细胞系中调节ING5的miRNAs基因并作进一步的机制研究。

综上所述，ING5能够促进卵巢癌细胞系A2780对顺铂的敏感性，这可能为临床检测卵巢癌患者预后及对顺铂的敏感性提供了新的分子标志物，为克服卵巢癌顺铂耐受提供了新思路。

[1] Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin, 2010,60(5):277-300.

[2] Shiseki M, Nagashima M, Pedeux R M,et al. p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300,and enhance p53 activity[J]. Cancer Res, 2003,63:2373-8.

[3] Hanahan D,Weinberg R A. Hallmarks of cancer: the next generation[J].Cell, 2011,144(5):646-74.

[4] Fesik S W. Promoting apoptosis as a strategy for cancer drug discovery[J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(11):876-85.

[5] He G H,Helbing C C,Wagner M J,et al.Phylogenetic analysis of the ING family of PHD finger proteins[J]. Mol Biol Evol, 2005,22(1):104-16.

[6] Coles A H,Jones S N.The ING gene family in the regulation of cell growth and tumorigenesis[J]. J Cell Physiol, 2009,218(1):45-57.

[7] Russell M,Berardi P,Gong W,et al.Grow-ING, Age-ING and Die-ING:ING proteins link cancer, senescence and apoptosis[J]. Exp Cell Res, 2006,312(7):951-61.

[8] Soliman M A,Riabowol K. After a decade of study-ING, a PHD for a versatile family of proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2007, 32(11):509-19.

[9] Doyon Y,Cayrou C,Ullah M,et al.ING tumor suppressor proteins are critical regulators of chromatin acetylation required for genome expression and perpetuation[J]. Mol Cell, 2006, 21(1):51-64.

[10] Cengiz B,Gunduz E,Gunduz M,et al.Tumor-specific mutation and downregulation of ING5 detected in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Cancer,2010,127(9):2088-94.

[11] Li Y,Deng H,Lv L,et al.The miR-193a-3p-regulated ING5 gene activates the DNA damage response pathway and inhibits multi-chemoresistance in bladder cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(12):10195-206.

Expression and influence of ING5 on cisplatin sensitivity in different ovarian cancer cells

Sun Zhengwei1,2,Ma Rong1,2, Wan An1,et al

(1Dept of Obstetrics and Gynecology,The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001；2DeptofGynecologicTumor，AnhuiCancerHospital,Hefei230000)

Objective To investigate the expression level and effect of inhibitor of growth protein 5(ING5) in ovarian cancer cell which has different sensitivity to cisplatin. Methods MTT method was used to analyze the sensitivity of difference in ovarian cancer cell line A2780, SKOV-3, HO8910, ES-2 to cisplatin,and to determine the 50% inhibiting concentration (IC50) value; the expression level of ING5 protein in A2780, SKOV-3, HO8910 and ES-2 cells was determined by Western blot; SiRNA against ING5 was used to silence ING5 gene and the knockdown efficiency was verified by Western blot,and the change of the sensitivity to cisplatin in A2780 cells after transfection was detected by MTT method.Results A2780 was the most resistant cell line to cisplatin, which IC50 value was (0.423±0.020) μg/ml; ES-2 was the most resistant cell line to cisplatin, with IC50 value of (5.280±0.309) μg/ml (P<0.01). However, ING5 protein level was the highest in A2780 cells, but the lowest in ES-2 cells(P<0.01). Knockdown of the ING5 by siRNA significantly reduced the sensitivity of A2780 cells to cisplatin(P<0.01).Conclusion High expression of ING5 might improve the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin.

ovarian cancer cells; cisplatin; drug resistance; ING5

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.026.html

安徽省科技厅年度重点科研项目(编号：1301043053)

1安徽医科大学附属省立医院妇产科，合肥 230001

2安徽省肿瘤医院妇瘤科，合肥 230000

孙正伟,男,硕士研究生；

赵卫东,男,副教授,主任医师,硕士生导师,责任作者，E-mail:victorzhao@163.com

R 711.75

A

1000-1492(2016)01-0056-04

2015-10-20接收