稳定表达NLRC5基因肝癌细胞株的建立

何莺华，徐 涛，倪明明，黄 成，李 娟，孟晓明，李 俊



稳定表达NLRC5基因肝癌细胞株的建立

何莺华1，徐 涛1，倪明明1，黄 成1，李 娟2，孟晓明1，李 俊1

目的 建立起能够稳定表达NLRC5基因的肝癌HepG2细胞株。方法 设计遗传霉素(G418)的浓度梯度，通过对HepG2 细胞筛选最终确定筛选药物浓度。将构建好的人源pEGFP-C2-NLRC5重组质粒利用脂质体介导法转染至HepG2肝癌细胞株中，用G418筛选出耐药阳性克隆。通过免疫荧光技术观察绿色荧光蛋白稳定表达情况，Western blot法验证NLRC5蛋白表达情况。结果 G418在14 d内使HepG2细胞全部死亡的最小浓度是300 ng/ml。用G418筛选瞬转pEGFP-C2-NLRC5 14 d在荧光显微镜下可见耐药克隆的形成。Western blot法检测显示，稳定过表达组NLRC5的蛋白水平比空质粒转染组高(t=15.356，P<0.05)。结论 成功构建稳定表达NLRC5基因的肝癌细胞株，为进一步研究NLRC5基因在肝癌的体内实验奠定了基础。

NLRC5;肝癌;稳定细胞株;HepG2

肝细胞肝癌约占原发性肝癌的90%，已成为全世界最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在肿瘤相关死因中位列第三[1]。而肝癌的发生、发展主要与肝脏慢性炎症等免疫反应所导致的肝细胞反复损伤与增生密切相关[2-3]，深入了解和掌握免疫反应的分子机制将为今后治疗与炎症相关的癌症提供帮助。天然免疫系统中的核苷酸结合寡聚结构域样受体(nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat containing receptors,NLRs)家族成员之一，NLR家族含半胱天冬酶激活招募结构域5(NOD-like receptor family CARD domain containing 5, NLRC5)蛋白分子，其在抗病毒免疫过程、炎症小体形成以及主要组织相容性复合体-1(major histocompatibility complex- 1, MHC-I)分子基因转录过程中均有参与，但其具体的机制尚不能确定[4]。研究[5]显示NLRC5在人肝星状细胞(LX-2)中能正向调节核转录因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)/Smad3通路介导白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)的分泌，提示NLRC5在肝癌的发生发展中可能有所参与。该研究建立能够稳定过表达NLRC5的HepG2细胞株，为研究NLRC5在肝癌中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞株HepG2由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 无内毒素质粒大提试剂盒(北京康为世纪生物有限公司)；质粒小抽试剂盒(美国AxyGen公司)；LB-Kana液体培养基由本实验室配制；G418、LiprofectamineTM2000、Opti-MEM(美国Invitrogen公司)；PCR扩增试剂盒、引物(上海生物工程有限公司)；一抗(英国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 人源重组真核表达载体pEGFP-C2-NLRC5质粒抽提及鉴定 取微量pEGFP-C2和pEGFP-C2-NLRC5质粒转化DH5α 感受态细菌，将其涂布于LB-Kana琼脂培养基上，37 ℃倒置过夜，第2天挑取单个菌落接种于8 ml LB-Kana液体培养基，37 ℃、150 r/min摇菌14 h。20%甘油保留1 ml菌液，其余菌液用小抽试剂盒抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性重组质粒菌液。将阳性重组质粒菌液扩大摇菌后使用去内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定并测定其浓度，-20 ℃保存。

1.2.2 确定G418筛选浓度 取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化，计数板计数，12孔板中每孔接种1 000个细胞。待细胞贴壁后，梯度加入G418，其浓度分别是100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 ng/ml， 37 ℃、5% CO2培养箱培养，每隔1 d更换1640完全培养基1次，对每孔细胞生长情况多进行观察。筛选14 d后，观察每孔细胞死亡情况，将全部杀死细胞的最小浓度确定为最终药物筛选浓度。

1.2.3 人源pEGFP-C2-NLRC5重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2 将HepG2细胞消化重悬接种至6孔板中，置37 ℃、5% CO2培养，待细胞融合生长至70%～80%进行转染。将1 μg质粒和5 μl LiprofectamineTM2000分别溶于250 μl Opti-MEM培养基中，孵育5 min后将两者混合，室温静置20 min。无菌PBS洗涤细胞2次后每孔加入1.5 ml Opti-MEM，再缓慢加入上述混合物，置37 ℃、5% CO2培养6 h后更换含1640完全培养液继续培养，24 h后在荧光显微镜下观察转染情况并拍照，带有绿色荧光的细胞即为重组质粒转染成功的细胞，经G418筛选、单克隆后得到稳定过表达组，实验中同时设置未转染组和空质粒转染组。

1.2.4 筛选稳定转染细胞株 HepG2细胞经脂质体瞬时转染24 h后，以300 ng/ml的G418药物浓度筛选，每隔1～2 d更换含有G418的完全培养基，约6 d细胞出现大量死亡，换用特殊培养基培养。特殊培养基的制备方法：HepG2生长融合约达80 %，换液，培养过夜，收集培养基，滤器消毒，和新鲜培养基1 ∶1混合。待未转染组细胞全部被杀死后继续筛选，转染组可见耐药克隆形成。将耐药克隆消化，有限稀释法稀释至96孔板中，每孔1个细胞，用特殊培养基培养，继续加药筛选，30 d后在荧光显微镜下选取阳性孔，接种至新的培养皿中扩大培养，培养期间保持300 ng/ml的G418药物浓度，1周后进行鉴定。

1.2.5 Western blot法检测稳定过表达组NLRC5的蛋白表达 取稳定过表达组、空质粒转染组细胞，两组细胞数相同，使用RIPA强裂解液(含1%的蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，加蛋白上样缓冲液，100 ℃、10 min后收好蛋白保存至-20 ℃。配8% SDS-PAGE凝胶，加25 μl蛋白，电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，TBST洗膜后，一抗孵育。次日TBST洗膜，在5%脱脂奶粉中加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL发光剂，电脑显影成像。

2 结果

2.1 质粒小抽后鉴定 将摇菌后的菌液按小抽试剂盒说明书抽提质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker比对，发现第5组质粒没有在大小符合的位置出现条带，说明这组单克隆菌液中并不含重组载体，应该丢弃。见图1。

图1 RT-PCR鉴定质粒小抽

M:Marker; 1：挑取的1号单克隆；2：挑取的2号单克隆；3：挑取的3号单克隆；4：挑取的4号单克隆；5：挑取的5号单克隆；6：挑取的6号单克隆

2.2 显微镜下观察确定G418 筛选药物浓度 接种HepG2细胞的12孔板，经不同浓度G418筛选14 d后在显微镜下观察细胞的死亡情况，发现300 ng/ml以及比其浓度更高的G418浓度可将细胞全部杀死，最终确定G418筛选浓度为300 ng/ml。见图2。

图2 G418不同浓度筛选14 d后HepG2细胞结果 ×100

A：100 ng/ml；B：200 ng/ml；C：300 ng/ml；D：400 ng/ml；E：500 ng/ml；F：600 ng/ml

2.3 荧光显微镜下观察稳定细胞株的筛选情况 细胞经脂质体转染后，因重组质粒携带GFP绿色荧光基因以及 Neomysin 抗性基因，若质粒基因转入细胞内，则在荧光倒置显微镜中可观察到绿色荧光并能够在G418 筛选压力下存活。结果如图3所示，转染后24 h，荧光显微镜下可见绿色荧光细胞团；G418 持续筛选14 d后，单克隆化的细胞耐药群形成。

图3 荧光显微镜下观察NLRC5蛋白表达 ×200

2.4 稳定细胞株中NLRC5蛋白的表达 Western blot法检测结果显示，稳定过表达组和空质粒转染组的细胞内均有NLRC5蛋白表达，稳定过表达组NLRC5蛋白表达明显高于空质粒转染组，差异有统计学意义(t=15.356，P<0.05)，见图4。

图4 Western blot法检测NLRC5蛋白表达

1：空质粒转染组；2：稳定表达组；与空质粒转染组比较：*P<0.05

3 讨论

NLRs是细胞内模式识别受体家族，该家族包括5个亚家族，其中在人类至少发现了23个成员，在鼠中至少发现了34个成员。 这些成员通常含有3个结构区域: 碳端为亮氨酸重复区域，能够识别相应的配体；中部区域为中心核酸结合结构域，在NLRs与核苷酸链的结合以及自我聚合方面具有重要作用[6]。NLRs的氨基端为半胱天冬酶激活招募结构域、热蛋白结构域，能够结合下游效应分子从而激活NLRs，故这个区域称为功能结构域。近期新发现的NLRC5是NLRs家族中的一员，其基因定位于人类基因组的16q13，基因全长约96 000 bp[7]，编码蛋白由1 866个氨基酸分子组成，是所有NLRs家族中分子量最大的一个成员。研究[8]显示，NLRC5在人类及小鼠的多种组织中都能表达，造血细胞中具有较高的表达量，人体和小鼠骨髓、淋巴结、胸腺和脾这些免疫组织具有高表达量的mRNA[8-10]。

NLRC5被证明能够参与到多种免疫反应，但其在免疫调节过程中具体扮演什么角色还具有争议性。Cui et al[11]研究发现NLRC5负向调节NF-κB途径以及I型干扰素信号发生途径。Tong et al[12]发现NLRC5基因缺陷性小鼠在受到水疱性口炎病毒感染后，体内多种细胞内的NF-κB以及I型干扰素信号途径得到了加强。Neerincx et al[9]发现切除NLRC5基因的人单核细胞(THP-1)以及人真皮成纤维细胞受到Sendai病毒及聚胞嘧啶核苷酸感染后，胞内I型干扰素表达量会降低，认为NLRC5是I型干扰素产生途径中的一个正向调节子。最近研究[5]显示NLRC5在LX-2细胞中正向调节NF-κB/Smad3通路介导IL-6和IL-1β的分泌。有关NLRC5在免疫反应中的作用的研究很多，但其在炎症小体的形成过程中所起的激活作用尚不明确。然而慢性炎症终归是导致癌症的主要原因之一，发展免疫疗法也成为治疗癌症的理想靶点分子[13]。

脂质体瞬时转染中，外源性基因片段整合到基因组的概率非常低，主要以染色体外的形式存在，并且不能随细胞分裂一同复制，常用于24～72 h内就进行处理分析结果的实验中。而稳定转染相对于瞬时转染而言，其进入细胞的质粒能整合入基因组中，随细胞的分裂一同复制。但稳定转染并不是不同于瞬时转染的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。通过构建稳定表达NLRC5的细胞株可以大大降低转染该基因的频率，降低成本，方便实验研究。并且在后续动物实验中，需要向动物体内注射表达有外源片段的细胞，需要构建稳定表达细胞株，以防止注射入动物体内后，外援片段很快丢失。

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[4] 陈亚冰, 兰道亮, 汤 程, 等.NLRC5:一种新发现的天然免疫调节分子[J].中国兽医科学,2013,43(4):436-40.

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[6] Magalhaes J G, Sorbara M T, Girardin S E,et al. What is new with Nods? [J].Curr Opin Immunol,2011,23(1):29-34.

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[13] Oldstone M B.Virus-lymphoid cell interactions[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2012,93(23):12756-8.

Construction of stable a human hepatoma cell line HepG2 with over-expression of NLRC5

He Yinghua, Xu Tao, Ni Mingming, et al

(School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032)

Objective To establish a human hepatoma cell line HepG2 with over-expression of NLRC5. Methods Identified the suitable G418 concentration in the selection of stable transfection HepG2 cell. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-C2-NLRC5 was transfected into the HepG2 cells mediated by lipofectamine and then selected with G418. Immunofluorescence assay and Western blot were used to analyze the expression of NLRC5. Results HepG2 cells were killed by G418 after 14 days with the minimum concentration of 300 ng/μl. Drug-resistant clones were formed after 14 days by selecting with G418. In the protein level, pEGFP-C2-NLRC5 HepG2 cell line was higher expression than pEGFP-C2 HepG2 cell line, the difference was statistically significant. Conclusion A hepatoma stable cell line over-expressing NLRC5 is successfully established, which may provide critical foundation for functional research of NLRC5 in liver cancer.

NLRC5; liver cancer; stable cell line; HepG2

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.004.html

国家自然科学基金(编号：81473268、81202978)；安徽省自然科学基金(编号：1308085MH145)

1安徽医科大学药学院，合肥 230032

2合肥瑶海区长淮街道社区卫生服务中心，合肥 230011

何莺华，女，硕士研究生；

李 俊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail: lj@ahmu.edu.cn

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0005-04

2015-10-20接收