不同二氧化碳浓度培养对两株栅藻碳固定速率及油脂积累的影响

郭 琪郑凌凌沈 伟宋立荣

（1. 中国科学院水生生物研究所， 中国科学院藻类生物学重点实验室， 武汉 430072； 2. 中国科学院大学， 北京 100049）

研究简报

不同二氧化碳浓度培养对两株栅藻碳固定速率及油脂积累的影响

郭 琪1，2郑凌凌1沈 伟1宋立荣1

（1. 中国科学院水生生物研究所， 中国科学院藻类生物学重点实验室， 武汉 430072； 2. 中国科学院大学， 北京 100049）

人类在利用化石燃料的过程中会导致大量有害温室气体CO2的排放， 促进全球气候变暖。微藻可通过光合作用固定CO2， 同时大量的微藻生物质还能作为生物能源的原料［1］， 因此， 越来越多的研究关注于微藻生物固碳以达到降低碳排放的目的。利用微藻光合作用进行CO2固定是一种能量节约型和环境友好型技术手段［2］。

在利用微藻进行CO2生物固定以及生物燃料生产时，研究微藻的CO2固定能力、CO2对微藻的生长以及油脂积累的影响等都是十分重要的。国内外利用微藻进行生物固碳已有大量报道， 夏建荣等［3］通过研究极大螺旋藻的生长， 发现添加高浓度CO2有利于提高螺旋藻产量；Morais等［4］研究发现4株微藻Chlorella kessleri、C. vulgaris、Scenedesmus obliquus 和Spirulina sp. 在6% CO2浓度下达到最大生长速率； Tang等［5］的研究结果显示S.obliquus 在10% CO2浓度条件下具有最大生长速率和碳固定速率； Fulke等［6］的研究结果表明Chlorella sp. 生长和油脂积累的最适CO2浓度为3%； 李爱芬等［7］研究发现通入0.5% CO2促进了核粉油球藻的生长以及不饱和脂肪酸的积累； 另外， Chiu等［8］的研究报道则显示Nannochloropsio culata 生长的最适CO2浓度为2%， 当CO2浓度超过一定范围（＞5% CO2）， 会对微藻生长产生抑制作用。工业排放废气中CO2浓度往往高达10%—15%， 甚至更高［9］， 因此欲利用微藻进行CO2固定实现减排， 藻种的选取显得极为重要。

前期经过初步筛选获得了油脂含量较高的栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600， 在此基础上， 探究了它们在不同CO2浓度下的生长、CO2固定以及油脂积累情况， 为筛选评价高效固碳且富含生物油脂的优良微藻种质资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 藻种来源及培养

栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600藻种来自中国科学院淡水藻种库。培养基BG-11［10］（去除Na2CO3， 以同等Na+摩尔浓度的NaCl代替， 排除外源碳源的影响）， 光照强度150 μmol/（m2·s）， 持续光照培养， 温度为（25±1）℃。

采用长60 cm、内径2.6 cm的柱状光反应器培养， 通入气体浓度设置为10% CO2、5% CO2和空气， 每组三个平行， 气体流量为400 mL/min。初始接种浓度为A680=0.2， 培养周期为18d。

1.2 生物量测定

生物量以藻细胞干重（DW）来表示， 接种后， 每3天取V mL藻液， 用GF/C滤膜（Whatman， UK）抽滤， 滤膜提前烘干至恒重并记录重量为W0（g）， 然后将滤有藻细胞的滤膜置于105℃， 24h烘干至恒重， 并再次称重记录重量为Wt（g）。

生物量X （g/L）计算公式即为: X （g/L）=1000×［Wt（g）-W0（g）］/V （mL）

生物量产率P ［mg/（L·d）］=1000×（X1-X0）/（t1-t0）

比生长速率μ （/d）=（lnX1-lnX0）/（t1-t0）

其中， X1、X0分别为t1、t0时间下的生物量。

1.3 CO2固定速率测定

Rco2=Cc×P×（Mco2/Mc）， Cc表示微藻细胞中的含碳量， P是生物量产率， Mco2和Mc分别表示CO2分子和C元素的分子量。参考Chisti［11］的微藻生物质的分子式CO0.48H1.83N0.11P0.01， Cc约为51.37%， 计算CO2固定速率=1.88×生物量产率［mg/（L·d）］。

1.4 油脂提取

取一定体积的藻液离心收集， 并冻干至藻粉。参考Bigogno等［12］的方法提取油脂: 称取干燥的藻粉W1（g）（50 mg≤W1≤100 mg）， 经10%的二甲亚枫-甲醇溶液（v/v）和正己烷︰乙醚混合液（1︰1， v/v）抽提得到上层有机相， 氮气吹干浓缩后， 转移浓缩液到已称重为W2（g）的玻璃瓶中， 再经氮气吹干至恒重， 称重玻璃瓶质量W3（g）。

总脂百分含量（% DW）=［（W3-W2）/W1］×100%

油脂产率［mg/（L·d）］=生物量产率×总脂百分含量

1.5 脂肪酸组成

参照Lee 等［13］的方法进行。取1 mg提取的总脂样品，进行脂肪酸甲酯化反应， 经NaCl饱和溶液和正己烷萃取得到上层有机相， 氮气吹干后， 用正己烷定容至1 mL， 待气相色谱检测。

1.6 数据分析

实验数据采用平均值±标准差表示， 数据采用Origin 8和SPSS 18.0分析软件进行分析， 各组实验数据的显著性差异分析利用SPSS 18.0统计软件进行， 显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 不同CO2浓度对两株栅藻生长的影响

如图 1所示， 两株栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在较高CO2浓度（5%和10% CO2）培养下生长良好， 生长速率明显快于空气组。第18天， Scenedesmus sp. FACHB-1545的最大生物量达到5.973 g/L （5% CO2）， Scenedesmus sp. FACHB-1600的最大生物量达到5.503 g/L （10% CO2）， 分别是空气组的2.3倍和1.6倍； 此外， 两株栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600均在10% CO2下获得最大生物量产率和最大比生长速率， 最大生物量产率分别为0.818和1.146 g/（L·d）， 最大比生长速率分别为1.298和1.415 /d 。

2.2 不同CO2浓度对两株栅藻碳固定速率的影响

如图 2所示， 相比空气组， 两株栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在较高浓度的CO2（5%和10%）下均表现出更高的固碳速率， 并且随着碳浓度的升高， 藻株的碳固定速率随之升高。Scenedesmus sp. FACHB-1545在10% CO2浓度下达到最大碳固定速率， 稍高于5% CO2培养组， 分别为1.538和1.378 g/（L·d）， 两者都显著高于空气组［0.271 g/（L·d）；P＜0.05］。藻株Scenedesmus sp. FACHB-1600也在10% CO2下有最大碳固定速率， 为2.155 g/（L·d）， 显著高于空气组［0.381 g/（L·d）； P＜0.05］。

图 1 两株栅藻在不同CO2浓度培养下的生物量浓度（平均值±标准偏差）Fig. 1 Biomass of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

2.3 不同CO2浓度对两株栅藻油脂积累及脂肪酸组成的影响

CO2浓度的增加与栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600总脂含量并无显著相关性（表 1）。Scenedesmus sp. FACHB-1545的油脂产率随着CO2浓度的升高而增加， 在5% CO2浓度和10% CO2浓度时获得的油脂产率分别为101.132和101.857 mg/（L·d）， 两者都显著高于空气组的油脂产率［52.5 mg/（L·d）；P＜0.05］； 而Scenedesmus sp. FACHB-1600则在5% 的CO2浓度下油脂产率最大， 为104.163 mg/（L·d）， 在10% CO2浓度时的油脂产率次之， 为86.729 mg/（L·d）， 而空气组最低， 为68.912 mg/（L·d）。

两株藻Scenedesmus sp. FACHB-1545Scenedesmus sp. FACHB-1600的脂肪酸组成主要成分为C16-C18脂肪酸， 在3个CO2浓度下， C16-C18含量占脂肪酸组成的85% 以上。Scenedesmus sp. FACHB-1545的不饱和脂肪酸相对含量达到82%以上， 而Scenedesmus sp. FACHB-1600的不饱和脂肪酸相对含量则达到91%以上，符合生物柴油的性质， 这两株栅藻具备生产生物柴油的潜力（表 2）。

3 讨论

CO2是微藻光合作用的碳源， 对大多数微藻来说， 最适CO2浓度通常在0.038%—10%［14］。通入合适浓度的CO2可以促进微藻的生长， 当CO2浓度超过一定范围时，其生长可能会受到抑制。Cheng等［15］研究发现Chlorella vulgaris 在通入1% CO2时生长良好， 但CO2浓度超过1%时其生长会受到影响； Lee等［16］的研究发现Chlorella pyrenoidosa能够在5% CO2浓度下较好的生长， 当CO2浓度高于5% 时， 生长也会受到抑制； 还有些藻株能够在富含高浓度CO2的烟道气（10%—15%）中生长， 但是固碳速率和生物量产率却不及较低CO2浓度培养［17］。Tang等［5］对Scenedesmus obliquus SJTU-3和Chlorella pyrenoidosa SJTU-2的研究发现， 这两株微藻在10%的CO2浓度下生长最快， 最大生物量浓度分别为1.84和1.55 g/L； Anjos等［18］发现通气速率为36 mL/min时， 随着CO2浓度的增加（2%—6%）， Chlorella vulgaris p12的最大生物量浓度和生物量产率增加了近45%。

图 2 两株栅藻在不同CO2浓度培养下的CO2固定速率（平均值±标准偏差）Fig. 2 CO2fixation rate of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

表 1 两株栅藻在不同CO2浓度培养下的总脂含量和油脂产率（平均值±标准偏差）Tab. 1 The total lipid and lipid productivity of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

本文研究的两株栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在10% CO2浓度下均具有最大生物量产率， 这与Tang等［5］的结果相似， 由于本实验采用的柱状光生物反应器， 促进了藻株在培养过程中的光利用率、营养盐利用率等， 最大生物量可高达5.973和5.503 g/L， 明显高于Tang等［5］所得到的最大生物量浓度。此外， Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在5%和10% CO2浓度下具有很好的固定碳的能力， 在10%浓度下固碳速率最高。Cervantesa等［19］研究Scenedesmus obtusiusculus 在不同CO2条件培养下也有相似结果， 该藻株在10% CO2下表现出最大CO2固定速率为970 g/（m3·d）； Wang等［20］研究了海洋硅藻Chaetoceros muelleri 在不同CO2浓度下的变化， 发现C. muellleri 在10% CO2下具有最大CO2固定速率0.428 g/（L·d）， 而本研究中的两株藻的最大固碳速率分别为1.538和2.155 g/（L·d）， 固碳速率具有明显优势， 表明它们是进行生物固碳的潜在优质藻种资源。因CO2的固定还会受如pH、光强、气体流速、CO2补给速率等条件的影响［20］， 后期还需针对这些因素深入研究藻种的固碳速率，进一步挖掘固碳潜力。

表 2 两株栅藻在不同CO2浓度培养下的脂肪酸组成Tab. 2 The fatty acid composition of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations

评价微藻生物柴油生产的经济可行性， 需综合考虑微藻生物量产率、总脂含量以及油脂产率等参数。近来有一些研究报道指出， 在一定范围内CO2浓度的升高可以促进油脂的积累。徐芳等［21］研究Nannochloropsis sp.时发现， CO2浓度的升高会降低总脂肪酸含量； Chiu等［8］研究N. oculata NCTU-3时发现， CO2浓度为2% 时油脂含量最高， 但是CO2浓度在2%—15% 时， 油脂含量有降低趋势。本研究中的藻株Scenedesmus sp. FACHB-1545和 Scenedesmus sp. FACHB-1600， 在通入较高浓度的CO2培养时， 都获得了高于空气组的油脂产率， 并且差异显著（P＜0.05）， 这表明我们筛选的两株栅藻在较高浓度CO2下能够很好的积累油脂。油脂产率是结合了生物量和总脂含量的综合评价指标， 能够更好地衡量藻株的产油能力［22］， 特别是在一些藻种的室外大规模培养时， 参考油脂产率来衡量藻株的产油潜力更加具有实际意义。

本文结果显示， 通过适当提高CO2浓度可以促进两株栅藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600的生长、CO2固定和油脂产率， 藻种具有高效固碳且富含生物油脂的优势。从应用角度看， 室内筛选的优良藻株能否推广到户外大规模生产， 还需考察藻株的其他一些性能如抗逆性、抗污染能力、采收性能等［20］， 本文研究的两株栅藻， 尚需开展进一步户外试验，以确定其是否能真正进行户外生产。

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EFFECTS OF DIFFERENT CO2CONCENTRATION ON CO2FIXATION AND LIPID ACCUMULATION OF TWO STRAINS OF SCENEDESMUS SP.

GUO Qi1，2， ZHENG Ling-Ling1， SHEN Wei1and SONG Li-Rong1
（1. Key Laboratory of Algal Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

栅藻； 生物量产率； CO2固定速率； 油脂产率

Scenedesmus sp.； Biomass productivity； CO2fixation rate； Lipid productivity

10.7541/2016.55

Q949.9

A

1000-3207（2016）02-0414-05

2015-04-01；

2015-08-21

国家高技术研究发展计划 ［Supported by National High-tech R&D Program of China （2014AA022001）］

郭琪（1990—）， 女， 湖北仙桃人； 硕士； 从事产油微藻固碳研究。 E-mail: guoqi900520@163.com

宋立荣， E-mail: lrsong@ihb.ac.cn