S-(-)-尼古丁在气相和水相存在形式的计算

蒋举兴，吴俊，王明锋，段焰青，李源栋，吴少华

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明五华区红锦路367号 650231；2 红云红河烟草（集团）有限责任公司技术中心，云南昆明五华区红锦路367号 650231；3 云南大学省微生物研究所，云南昆明五华区一二一大街182号 650091

烟草和烟气化学

S-(-)-尼古丁在气相和水相存在形式的计算

蒋举兴1,2，吴俊1,2，王明锋1,2，段焰青1,2，李源栋1,2，吴少华3

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明五华区红锦路367号 650231；2 红云红河烟草（集团）有限责任公司技术中心，云南昆明五华区红锦路367号 650231；3 云南大学省微生物研究所，云南昆明五华区一二一大街182号 650091

为研究在卷烟烟气总粒相物和人体pH条件下，游离态、两种单质子化形式和二质子化形式尼古丁的相对百分含量，在气相和水相B3LYP/6-311++G (d,p)水平，分别对3种形式尼古丁的稳定构象进行了优化，计算了气相和水相玻尔兹曼分布百分比、气相质子结合能、玻尔兹曼加权溶剂化能等物理化学参数，并根据尼古丁的pKa常数计算了中式卷烟烟气总粒相物中游离态形式在总尼古丁中的含量。计算结果显示：（1）在气相中，两种单质子化形式尼古丁共存，两者可以相互转化，处于动态平衡中；（2）在气相中尼古丁的单质子化主要发生在吡啶环N原子上，在水相中尼古丁的单质子化主要发生在四氢吡咯环N原子上；（3）在中式卷烟烟气总粒相物中游离态形式在总尼古丁中的含量约为0.3%～1.9%。

尼古丁；单质子化尼古丁；玻尔兹曼分布；密度泛函理论计算

S-(-)-尼古丁是各种烟草制品产生生理感受的重要化学物质基础，其结构见图1，在烟气中其占总尼古丁含量的97%左右。在烟草及烟气总粒相物中大部分尼古丁与有机酸结合成盐以质子化形式存在，非质子化的游离态烟碱含量较少，随着烟草及烟气碱性的增强，游离态烟碱含量增加。尼古丁分子中有两个N原子，因此单质子化既可以发生在四氢吡咯环N原子上（以H+-Nsp3形式表示），也可以发生在吡啶环N原子上（以H+-Nsp2形式表示）。虽然现在一般认为，在人体生理pH条件下，尼古丁的单质子化发生在四氢吡咯环N原子上才能起到生理活性，但一直没有在卷烟烟气气溶胶和人体pH条件下游离态、H+-Nsp3形式、H+-Nsp2形式和二质子化形式尼古丁相对百分含量的报道。

Graton用HF/6-31G (d,p)方法[1]和Berthelot用AM1方法[2]，分别计算得到S-(-)-尼古丁的质子亲合能，校正后与实验值比较得到H+-Nsp3形式与H+-Nsp2形式的比例。Elmore等用HF/6-31G (d,p)方法对单质子化尼古丁等进行了优化和频率计算，在MP2/6-31G (d,p)和B3LYP/6-31G (d,p)水平计算了单点能，进而计算得到各构象的相对自由能，溶剂化模型为早前半经验的SPT/OPLS和SM5.42R[3]。这些研究对深入理解尼古丁的质子化过程起到了重要作用，但这些研究较早，使用计算基组水平较低，计算条件也较少。因此，系统研究S-(-)-尼古丁的几何结构深入理解尼古丁的存在形式，对阐明尼古丁与受体结合机理、进行尼古丁的激动剂和拮抗剂类药物设计等都具有意义[1,3-4]。

图1 S-(-)-尼古丁的结构式Fig. 1 Structure of S-(-)-nicotine

1 材料与方法

S-(-)-尼古丁、H+-Nsp3形式、H+-Nsp2形式和二质子化形式尼古丁的各构象几何结构与能量都使用GAUSSIAN 09软件包进行计算[5]，所有构象都在HF/sto-3G水平进行了全扫描优化，局部最低能量构象都在B3LYP/6-31G* 水平进行了重新优化，并在B3LYP/6-311++G (d,p)水平进行了气相和水相优化以得到更可靠的几何结构和能量，在水相的优化分别采用CPCM和SMD溶剂模型。对所有驻点都进行了振动分析计算以确认它们是稳定结构，同时得到计算相对自由能(ΔG)和相对焓(ΔH)所需的频率数据。根据吉布斯相对自由能，计算得到室温平衡时每一个构象的Boltzmann分布百分比[6]。

文献结果指出，H+-Nsp3形式与H+-Nsp2形式的尼古丁可能共存[1]。因此，它们之间应该是通过反应1和2相互转化，那么它们之间处于动态平衡状态，也就可以计算两种形式之间各构象的Boltzmann分布百分比。

尼古丁与质子结合生成H+-Nsp2形式或H+-Nsp3形式的质子亲合能(Proton affinity，PA)用式（1）计算，其中ΔH(H+) = 2.5 RT = 1.48 kcal/mol[7]。单质子化形式尼古丁与质子结合生成二质子化形式尼古丁的质子亲合能(PA)用式（2）计算。

2 结果与讨论

2.1 游离态、单质子化和二质子化形式尼古丁的气相构象

文献中，对S-(-)-尼古丁及其质子化形式各种构象的命名方法较多[1,3,8]，经过比较，本文参考Elmore的命名方法[3]，将H7-C7-C3-C2二面角接近0度的构象命名为构象A，H7-C7-C3-C2二面角接近180度的构象命名为构象B；根据尼古丁分子中N8位的甲基与吡啶环的相对朝向，将尼古丁命名为cis式或trans式；将单质子化尼古丁用H+-Nsp2形式或H+-Nsp3形式表示，二质子化尼古丁用H2++-nicotine形式表示。根据文献和本文计算结果，这样三个方面联合命名就可以具体指代尼古丁及其质子化形式的各稳定构象。

根据构象搜索和优化结果，尼古丁共有transA、transB、cisA、cisB四个稳定构象，见图2。单质子化发生在吡啶环N原子上的尼古丁共有H+-Nsp2transB、H+-Nsp2transA、H+-Nsp2cisB、H+-Nsp2cisA四个构象，单质子化发生在四氢吡咯环N原子上的尼古丁共有H+-Nsp3transA、H+-Nsp3transB、H+-Nsp3cisA、H+-Nsp3cisB四个稳定构象。二质子化尼古丁共有-nicotinetransA、-nicotinetransB、nicotinecisB、-nicotinecisA四个稳定构象。

图2 在气相B3LYP/6-311++G (d,p)水平优化得到S-(-)-尼古丁四个稳定构象的三维结构Fig. 2 Three dimensional structure of four S-(-)-nicotine conformations optimized at B3LYP/6-311++G (d,p) level

表1列出了在气相B3LYP/6-311++G (d,p)水平游离态、单质子化形式和二质子化形式尼古丁各稳定构象的相对电子能(ΔE)、相对吉布斯自由能(ΔG298K)、相对焓(ΔH298K)、玻尔兹曼分布百分比(P)和偶极矩(μ)。 从表1可以看出：（1）在气相，游离态尼古丁主要以transA和transB两种形式存在；（2）在气相单质子化尼古丁中，H+-Nsp2形式与H+-Nsp3形式尼古丁共存，单质子化优先在吡啶环N原子上进行，但两者的优势含量顺序与Graton等[1]和Berthelot等校正后的最终结论相反[2]；（3）在气相中，二质子化形式尼古丁主要以transA和transB两种形式存在；（4）在游离态、H+-Nsp3形式、H+-Nsp2形式和二质子化形式尼古丁的稳定构象中，transA和transB构象都是其对应形式中最稳定的两个构象，cisB和cisA构象都是其对应形式中相对能量较高的两个稳定构象，cisB和cisA构象在其对应形式中的玻尔兹曼分布百分比都接近零，这与Elmore等的气相计算结果一致[3]。

表1 在气相B3LYP/6-311++G (d,p) 水平游离态、H+-Nsp2形式、H+-Nsp3形式和二质子化形式尼古丁的相对电子能(ΔE)、相对吉布斯自由能(ΔG298K)、相对焓变(ΔH298K)、玻尔兹曼分布百分比(P) 和偶极矩 (μ)Tab. 1 Calculated relative electronic energies (ΔE), relative Gibbs free energy (ΔG298K), relative enthalpy (ΔH298K) and Boltzmann populations (P) for free, H+-Nsp2, H+-Nsp3, and dipronated nicotine at B3LYP/6-311++G (d,p) level in gas phase

2.2 两种单质子化形式和二质子化形式尼古丁的气相碱度

有机物的气相碱度(Gas-phase basicity，GB)是指有机物分子在气相条件下与质子的亲合能力，通常用化合物的气相质子亲合能 (PA) 大小来表示。质子亲合能越大，越容易接受质子，气相碱度即碱性越强。有机物的气相质子亲合能可以通过理论计算得到，但长期以来人们都是在溶液中测定有机物的碱性，两者有一定的差别。随着高压质谱(High pressure mass spectrometry，HPMS)和离子回旋共振(Ion cyclotron resonance spectrometry，ICR)等技术的发展和应用，使得人们在气相条件下测定分子本身固有的碱度成为可能。可以通过理论计算和实验测定分别得到有机物的碱度，以相互验证和指导对有机物分子特征的理解。

表2 在气相B3LYP/6-311++G (d,p) 水平游离态、H+-Nsp2形式、H+-Nsp3形式和二质子化形式尼古丁的玻尔兹曼加权吉布斯自由能(G298K)、焓(H298K) 和气相质子亲合能(PA)Tab. 2 Boltzmann weighted Gibbs free energy (G298K), enthalpy (H298K) and proton affinity (PA) for free, H+-Nsp2, H+-Nsp3, and dipronated nicotine at B3LYP/6-311++G (d,p) level in gas phase

从表2可以看出：（1）在气相中，尼古丁与质子结合生成H+-Nsp2形式的质子亲合能为967.5 kJ/mol，生成H+-Nsp3形式的质子亲合能为957.9 kJ/mol，都高于水的质子亲合能691.0 kJ/mol[9]，说明在气相中尼古丁分子可以从H3O+中夺取H+，生成H+-Nsp2和 H+-Nsp3形式的尼古丁；（2）生成H+-Nsp2形式的质子亲合能比生成H+-Nsp3形式高9.6 kJ/mol，而Graton理论计算未进行相关校正时得到H+-Nsp2形式的气相碱度（即质子亲合能）为936.6 kJ/mol，H+-Nsp3形式的气相碱度为926.9 kJ/mol，H+-Nsp2形式的气相碱度高于H+-Nsp3形式9.7 kJ/mol，因此本文该理论计算结果与Graton理论计算未进行相关校正时的结果非常接近[1]，所以在气相中尼古丁与质子结合更容易生成H+-Nsp2形式的尼古丁，这也证实表1中两种单质子化尼古丁形式的玻尔兹曼百分比优势顺序结果正确；（3）Graton等用FT-ICR方法测定得到尼古丁的气相质子亲合能实验值为932.6±0.5 kJ/mol[1]，该实验条件下H+-Nsp2形式与H+-Nsp3形式共存，表2中计算得到只生成H+-Nsp2和 H+-Nsp3形式尼古丁的质子结合能与该实验值都非常接近；（4）在气相中，玻尔兹曼加权的单质子化尼古丁与质子结合生成二质子化形式的质子亲合能为633.9 kJ/mol，低于水的质子亲合能691.0 kJ/mol[9]，说明在气相中单质子化尼古丁从H3O+中夺取H+的能力较弱。

表3 在水相B3LYP/6-311++G (d,p) 水平游离态、H+-Nsp2形式、H+-Nsp3形式和二质子化形式尼古丁的相对吉布斯自由能(ΔG298K)、玻尔兹曼分布(P)和玻尔兹曼加权溶剂化能（ΔG sol）Tab. 3 Calculated relative Gibbs free energy (ΔG298K), Boltzmann populations (P) and Boltzmann weighted solvation energy (ΔG sol) for free, H+-Nsp2, H+-Nsp3, and dipronated nicotine at B3LYP/6-311++G (d,p) level in water phase

2.3 游离态、单质子化和二质子化形式尼古丁的水相构象

从表3可以看出，CPCM模型和SMD模型计算结果都说明：（1）在水相中H+-Nsp3形式的玻尔兹曼分布百分比远大于H+-Nsp2形式，即在水相中H+-Nsp3形式的稳定性远大于H+-Nsp2形式，这与气相计算结果的优势顺序完全相反，与文献[1,8]结果一致；（2）在水相中H+-Nsp3形式尼古丁的transA和transB构象最稳定，这两个构象在单质子化尼古丁中含量大于95%；（3）H+-Nsp3形式的ΔGsol小于H+-Nsp2形式，说明H+-Nsp3形式在水相中的稳定性更高；（4）在水相中二质子化形式的transA和transB构象最稳定，同时二质子化形式的ΔGsol显著小于游离态和单质子化形式，说明在水相中二质子化形式的稳定性提高。

根据对卷烟烟气气溶胶检测的统计结果，在气相中，水的含量为1.3%左右，仅次于空气成分和一氧化碳含量[10]；在粒相中，水的含量为10%左右[11]，为各种单质化学成分中含量最高的成分[10]。再者，烟气气溶胶pH值约为5～6。因此卷烟烟气气溶胶中各种形式尼古丁的含量情况，可能与水相计算结果最接近。

表4列出了反应3、4、5和6的玻尔兹曼加权反应自由能，可以看出：（1）尼古丁从水合质子中夺取质子生成H+-Nsp3形式的反应自由能为-160.84 kJ/mol（CPCM模型）或-129.99 kJ/mol（SMD模型），生成H+-Nsp2形式的反应自由能为-152.64 kJ/mol（CPCM模型）或-108.39 kJ/mol（SMD模型），因此，在水相中尼古丁从水合质子中夺取质子优先生成H+-Nsp3形式，这与2002年Graton等尼古丁在298 K水溶液中四氢吡咯环N原子的碱性略强于吡啶环N原子的结论一致[1]；（2）H+-Nsp2形式尼古丁从水合质子中夺取质子生成二质子化形式的反应自由能为-133.53 kJ/mol（CPCM模型）或-116.19 kJ/mol（SMD模型），H+-Nsp3形式尼古丁从水合质子中夺取质子生成二质子化形式的反应自由能为-125.34 kJ/mol（CPCM模型）或-94.60 kJ/mol（SMD模型），因此，在水相中H+-Nsp2形式尼古丁优先从水合质子中夺取质子生成二质子化形式。

表4 在水相B3LYP/6-311++G (d,p) 水平CPCM和SMD模型计算反应3、4、5和6的反应吉布斯自由能(ΔG)Tab. 4 Calculated reaction Gibbs free energy (ΔG) by CPCM and SMD model at B3LYP/6-311++G (d,p) level in water phase

2.4 主流烟气总粒相物中游离态尼古丁的含量

由于在水溶液中，尼古丁的pKa常数已经经过多次实验测定和验证[1,12-13]，所以本文未计算该常数而直接采用了文献中的实验值。文献中的实验结果显示，尼古丁分子有两个pKa值，在298 K水溶液中分别为8.02和3.12[13]。该条件下，吡啶环N原子的pKa值为3.12，四氢吡咯环N原子的pKa值为8.02[1]。

卷烟烟气气溶胶体系中存在多种有机弱酸和弱碱，是一个复杂体系，表明烟气气溶胶体系具有一定的缓冲能力，是一个缓冲体系。这样不同测定方法得到的中式卷烟烟气总粒相物pH值[11,14]就可以代表烟气气溶胶的实际pH值，因此通过化学反应平衡常数计算得到的各种形式尼古丁在总尼古丁中的含量[15]可以表征烟气气溶胶中的实际情况。所以可以通过式（3）、（4）和（5），结合尼古丁的pKa1= 8.02、pKa2=3.12[13]和卷烟烟气总粒相物pH值，分别计算得到游离态、单质子化和二质子化尼古丁在总尼古丁中的含量，也可以计算其它样品中各形式尼古丁的含量情况。本文对卢斌斌[11]报道的7种中式卷烟烟气总粒相物、陈建潭[16]报道的1种卷烟烟气总粒相物及人体血液中的游离态、单质子化和二质子化尼古丁在总尼古中的含量进行了计算，结果见表5。

表5 卷烟烟气中游离态、单质子化和二质子化尼古丁在总尼古丁中的含量Tab. 5 The ratio of free, mono-pronated, and dipronated nicotine to total nicotine in cigarette smoke

从表5可以看出，中式卷烟烟气总粒相物的pH值约为5.51～ 6.32，此时总粒相物中游离态形式在总尼古丁中的含量约为0.3%～1.9%；另外，人体血液的pH值为7.35～7.45，此时游离态形式在总尼古丁中的含量为17.6%～21.2%。根据本文CPCM模型计算结果，可以计算得到人体血液中， H+-Nsp3形式在总尼古丁中的含量为76.0%～79.5%， H+-Nsp2形式在总尼古丁中的含量为2.8%～2.9%，H2++-nicotine形式在总尼古丁中的含量为0.0%。

目前，实验测定卷烟烟气pH值和游离烟碱的方法比较多[14,17]，表6列出常见测定方法和测定结果。2000年，陈建潭等对9种卷烟烟气的测定结果显示，粒相物pH值越低，游离烟碱比率越低，但这只是相对普遍规律，实验中粒相物pH值最高为6.09的卷烟样品，其游离烟碱比率为10.3%[16]。2003年，Pankow等通过1H-NMR法测定雷诺公司Eclips卷烟烟气粒相物中游离烟碱含量为4.1%，计算得到粒相pH值为6.69[18]。2003年，Pankow等通过对多个日常生活和尼古丁性质相关数据的推导，分析了12种卷烟烟气粒相物中游离烟碱含量为1%～36%，计算得到粒相物pH值为6.0～7.8[19]。2004年，Waston等对美国市场最畅销的26种卷烟的检测结果表明，高焦油卷烟（14～17 mg/支）烟气中游离烟碱含量平均值为4.5%，低焦油卷烟（9～13 mg/支）烟气中游离烟碱含量平均值为6.8%，超低焦油卷烟（1～6 mg/支）烟气中游离烟碱含量平均值为14.7%（含量范围为9%～29%），超低焦油卷烟的检测结果支持了Pankow关于部分烟碱可能以挥发性游离态形式存在的推测[20]。2010年，Bao等采用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用，直接测定2R4F参比卷烟烟气中的游离烟碱，测定结果显示：ISO抽吸模式游离烟碱的含量为4.8%，而加拿大深度抽吸模式游离烟碱的含量为3.5%[21]。该研究还指出，温度、水分等操作条件和样品基质都会影响测定结果。2011年，汪秋安等采用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用，直接测定3R4F参比卷烟烟气中的游离烟碱，ISO抽吸模式的测定平均值为15.02 μg/支[17]，而该参比卷烟烟气的总尼古丁为0.726 mg/支[22]，由此计算得到3R4F参比卷烟烟气中的游离烟碱含量为2.1%。

表6 实验测定卷烟烟气的游离态尼古丁在总尼古丁中的含量Tab. 6 The ratio of free state nicotine to total nicotine in the cigarette smoke determined by references

根据文献报道的卷烟烟气中游离烟碱含量测定结果[16-21]与本文计算结果比较，可见实验测定结果和计算结果基本一致。但不同实验方法之间存在一定的偏差，这主要是由于测定方法、样品、测定条件不同造成的。特别是Pankow和Waston等[19-20]对国外超低焦油卷烟烟气粒相物中游离烟碱含量的测定值显著高于高焦油卷烟，这一方面可能是由于超低焦油卷烟与高焦油卷烟粒相物基质成分有一定差异，另一方面可能是由于方法的适用条件限制。

3 结论

（1）在气相中，单质子化尼古丁主要以H+-Nsp2形式存在，H+-Nsp3形式尼古丁的含量约为4.4%，H+-Nsp2形式尼古丁与H+-Nsp3形式共存，两者可以相互转化，处于动态平衡中。

（2）在气相中，尼古丁从水合质子中夺取质子优先生成H+-Nsp2形式；在水相中，尼古丁从水合质子中夺取质子优先生成H+-Nsp3形式。

（3）综合水相尼古丁各种形式构象的计算结果、卷烟总粒相物中游离态尼古丁的含量、人体生理理pH条件下计算与药物代谢研究结果，在中式卷烟烟气总粒相物中游离态尼古丁在总尼古丁中的含量约为0.3%～1.9%；在人体生理pH条件下，游离态形式在总尼古丁中的含量为17.6%～21.2%， H+-Nsp3形式在总尼古丁中的含量为76.0%～79.5%， H+-Nsp2形式在总尼古丁中的含量为2.8%～2.9%，H2++-nicotine形式在总尼古丁中的含量为0.0%。

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Calculation of nicotine in gas phase and water phase forms

JIANG Juxing1,2, WU Jun1,2, WANG Mingfeng1,2, DUAN Yanqing1,2, LI Yuandong1,2, WU Shaohua3
1 Research and Development Center, China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd., Kunming 650231, China;2 Technology Center, Hongyun-Honghe Tobacco (Group) Co., Ltd., Kunming 650231, China;3 Yunnan Institute of Microbiology, Yunnan University, Kunming 650091, China

The conformational percentage of nicotine in free, mono-protonated and dipronated forms in cigarette smoke were investigated under pH value of human body. Stable conformations of nicotine were optimized separately at B3LYP/6-311++G (d,p) level in gas phase and water phase. Boltzmann populations in gas phase and water phase, proton affinity, Boltzmann weighted solvation energy and other chemical parameters were also calculated. Ratio of free-state nicotine to total nicotine in Chinese-style cigarette smoke was calculated according to pKa constant of nicotine and pH value. Results showed that: (1) in gas phase, two forms of mono-protonated nicotine coexisted in dynamic balance; (2) in gas phase, mono-protonation of nicotine mainly occurred on the pyridine nitrogen, while on pyrrolidine nitrogen in water phase; (3) ratio of free-state nicotine to total nicotine in Chinese-style cigarette smoke ranged from 0.3% to 1.9%.

nicotine; mono-pronated nicotine; boltzmann population; density functional theory calculation

蒋举兴，吴俊，王明锋，等.S-(-)-尼古丁在气相和水相存在形式的计算[J]. 中国烟草学报，2016,22（3）

云南省科技厅项目“引导类工业[2014]01号”；中国烟草总公司科技项目“110201402040”

蒋举兴（1976—），博士，高级工程师，主要从事烟草化学和香精香料化学研究，Email：906805362@qq.com

吴少华（1975—），博士，教授，主要从事天然产物化学研究， Email：shwu123@126.com

2015-10-09

:JIANG Juxing, WU Jun, WANG Mingfeng, et al. Calculation of nicotine in gas phase and water phase forms[J]. Acta Tabacaria Sinica,2016,22(3)