食品中β2受体激动剂快速检测方法的建立与应用

2016-11-22韩宁娟

西北药学杂志 2016年6期

关键词：伦特罗莱克激动剂

韩宁娟，杜玮，常春，傅强*

(1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.西安培华学院，西安 710125)

·药物分析·

食品中β2受体激动剂快速检测方法的建立与应用

韩宁娟1,2，杜玮1，常春1，傅强1*

(1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.西安培华学院，西安 710125)

目的以4种β2受体激动剂为研究对象，建立薄层色谱法用于食品中非法添加的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林现场快速检测。方法考察不同固定相与展开剂，不同检测方式对食品中β2受体激动剂薄层色谱行为的影响并进行方法学验证。结果以硅胶HPGF254为薄层色谱的固定相，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)为展开剂，碘蒸气熏蒸后，在紫外光灯254 nm下检测4种β2受体激动剂鉴别特征明显，内源性物质无干扰。结论该方法灵敏度高，专属性强，操作简单，结果准确，可快速检测出食品中非法添加的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林4种β2受体激动剂。

β2受体激动剂；快速分析；薄层色谱法

A.stract:Objective To develop a TLC method for rapid detection of 4 kinds ofβ2agonists illegal additives (clenbuterol hydrochloride，ractopamine，salbutamol，and terbutaline sulfate) in food. Methods The TLC conditions， such as the stationary phase， the mobile phase and the different detection methods were investigated. And the established TLC method was validated for the real sample analysis. Results The optimal conditions were as follows: high performance silica gel HPGF254as the stationary phase， alcohol-cyclohexane-formic acid (13∶10∶1) as the mobile phase. After developed and colorized with iodine vapor，the coloration spots of the 4 kinds ofβ2agonists were obvious and no internal interference was observed under 254 nm wavelength. The developed method was sensitive and specific. Conclusion The established method is simple and accurate， and could be used for the rapid detection of the 4 kinds ofβ2agonists in food.

β2受体激动剂是一类结构和功能都类似肾上腺素的苯乙胺类衍生物[1]，临床上可用于扩张支气管和增加肺通气量，治疗支气管哮喘、平滑肌痉挛和休克等症[2]，具有脂肪再分配作用。然而，不法商贩将其添加于喂养动物的饲料中，以提高瘦肉产率，从中牟取暴利，这类肉制品或内脏被人食用后会在体内蓄积，产生心悸、四肢肌肉颤动、心律失常等不良反应[3]。因此，建立食品中这4种β2受体激动剂的检测方法具有重要意义。

目前，有文献报道检测食品中这4种β2受体激动剂主要采用的方法有高效液相色谱法[4-6]、液相色谱-质谱联用法[7]、气相色谱-质谱联用法[8]、毛细管电泳法[9]和酶联免疫吸附测定法[10]等，这些方法灵敏度高、专属性强，但分析成本高，仪器价格及日常维护费用昂贵，需要专门的仪器和专业的技术人员进行实验室检测，不能进行现场操作。酶联免疫分析法具有灵敏度高、简便、快捷等特点，但存在假阳性和单一性问题，不能满足多残留分析的要求[11]。为实现快速筛选食品中这4种β2受体激动剂，在已有报道的基础上[12]，本实验建立了薄层色谱法用于食品中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的快速检测，该方法灵敏度高、专属性强、操作简单，可用于食品中非法添加的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的现场快速分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器 KH5200数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；FA2004电子分析天平(上海精科天平有限公司)；KHB单道可调移液器(大龙医疗设备(上海)有限公司)；MTN-2800W氮气浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；SK-1快速混匀器(江苏盐城市华康科学仪器厂)；101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；微量点样器(宁波市镇海玻璃仪器厂)。

1.2 材料双槽展开缸(20 cm×20 cm)；薄层板(10 cm×20 cm)；薄层板(20 cm×20 cm)；毛细管(φ0.3 mm)；硅胶G板、硅胶GF254板(青岛海洋化工厂)；硅胶HPGF254板(烟台江友硅胶开发有限公司)。

1.3 试药盐酸克伦特罗(中国食品药品检定研究院，批号C11668550)；莱克多巴胺(武汉刚正生物科技公司，批号20071020)；沙丁胺醇(中国食品药品检定研究院，批号100204-201103)；硫酸特布他林(中国食品药品检定研究院，批号C17295000)。薄层层析硅胶H、硅胶G、硅胶GF254(化学纯，青岛海洋化工有限公司)；甲醇、氨水、异丙醇、环己烷、甲酸、醋酸、乙酸乙酯(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)。

1.4 样品 2批猪肉和2批羊肉分别购于西安市不同农贸市场。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备分别称取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品各10 mg，精密称定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2 对照品溶液的制备分别称取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品各10 mg，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取猪肉或羊肉样品2 g，精密称定，加生理盐水4 mL匀浆，并精密吸取上述对照品溶液100 μL，加入到匀浆液中，超声分散后加8 mL乙腈沉淀蛋白，以10 000 r·min-1离心10 min，上清液再以12 000 r·min-1离心10 min，氮气吹干，用500 μL甲醇溶解，得到不同质量浓度不同类型的生物模拟样品溶液，同法制备空白溶液和样品溶液。

2.4 显色与观察碘蒸气熏蒸后，在紫外光灯254 nm处观测。

2.5 薄层色谱条件考察

2.5.1 不同固定相考察分别吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于硅胶G、硅胶GF254和高效硅胶GF254不同类型的薄层板上，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)为展开剂展开，取出，晾干，在碘蒸气中熏蒸至斑点清晰，置于紫外光灯254 nm处检视，比较斑点清晰度和分离度，结果高效硅胶GF254板分离效果较好，重复性较好。

2.5.2 展开剂的选择配制乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)，浓氨溶液-水-异丙醇(4∶16∶5)，异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)等混合溶液，将盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品溶液和混合对照品溶液在同一薄层板(10 cm×20 cm)上点样，分别以上述这3种混合溶液作为展开剂，在展开缸里展开，取出，晾干，在碘蒸气下熏蒸后,置于紫外光灯254 nm处检视，结果见图1。记录Rf值，并照相记录，展开效果最好的展开系统是异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)，在此条件下各个斑点可清晰分离。

图1 不同展开系统薄层色谱图

A.乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)； B. 浓氨溶液-水-异丙醇(4∶16∶5)； C.异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)；

1.盐酸克伦特罗；2.莱克多巴胺；3.沙丁胺醇；4.硫酸特布他林；5.混合对照品溶液

Fig.1 TLC chromatograms of different developing systems

A. ethyl acetate-methanol-acetic acid (8∶1∶0.8)； B. concentrated ammonia solution-water-isopropyl alcohol (4∶16∶5)； C. isopropyl alcohol-cyclohexane-formic acid (13∶10∶1)；

1.clenbuterol hydrochloride；2.ractopamine；3.salbutamol；4.terbutaline sulfate；5.the mixed standard solution

2.5.3 点样量的选择依次取对照品溶液2，3，4，5和6 μL，点于同一薄层板上，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)作为展开剂在展开缸里展开，取出，晾干，在紫外光灯254 nm处检视，根据斑点颜色的分离度确定最佳点样量为5 μL。

2.5.4 不同检视方式的考察分别点盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品溶液和混合对照品溶液点于同一薄层板上，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)为展开系统，展开，取出，晾干，在碘蒸气中熏蒸至斑点清晰，在3种检视条件下(紫外光灯254和366 nm及可见光)进行检视，结果见图2，这4种β2受体激动剂在紫外灯254 nm处均斑点清晰，表明紫外光灯254 nm为最佳检测方法。

2.6 方法学考察

2.6.1 最低检测限的考察将盐酸克伦特罗对照品溶液稀释成质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg·mL-1的溶液，用微量点样器在同一个薄层板(10 cm×20 cm)进行点样8 μL，用异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)作为展开剂在展开缸里展开30 min，取出，晾干，在碘蒸气中熏蒸至斑点清晰，在紫外光灯254 nm处检视，记录Rf值。取莱克多巴胺8 μL、沙丁胺醇12 μL和硫酸特布他林5 μL对照品溶液，以同样方法进行最低检测限考察，当对照品斑点的大小与颜色达到肉眼刚能清晰辨认时确定为最低检测量，各药物的最低检测限见表1，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的最低检测限分别为0.24，0.24，0.48和0.20 μg。

图2 不同检测方式薄层色谱图

A.紫外光灯366 nm； B. 紫外光灯254 nm C. 可见光

1.盐酸克伦特罗；2.莱克多巴胺；3.沙丁胺醇；4.硫酸特布他林；5.混合对照品溶液

Fig.2 TLC chromatograms of different detection methods

A.under UV light at 366 nm； B.under UV light at 254 nm；C.under visible light

1.clenbuterol hydrochloride；2.ractopamine；3.salbutamol；4.terbutaline sulfate；5.the mixed standard solution

表1 最低检测限实验结果

Tab.1 Limit of detection (LOD) of the 4 kinds ofβ2agonists

对照品质量浓度/mg·mL-1盐酸克伦特罗(8μL)莱克多巴胺(8μL)沙丁胺醇(12μL)硫酸特布他林(5μL)0.01----0.02----0.03++--0.04++++0.05++++0.06++++0.07++++0.08++++0.09++++0.10++++

2.6.2 重复性实验将质量浓度为0.1 mg·mL-1的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品溶液和混合对照品溶液在同一薄层板(10 cm×20 cm)点样展开，重复6次，记录Rf值，并计算RSD值。结果盐酸克伦特罗的RSD值为4.11%，莱克多巴胺的RSD值为3.04%，沙丁胺醇的RSD值为5.84%，硫酸特布他林的RSD值为5.73%，结果表明，该薄层色谱法重复性较好。2.7 薄层鉴别系统验证分别吸取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林对照品溶液、混合对照品溶液和猪肉、羊肉的模拟样品溶液，对照品溶液各取5 μL，样品溶液各取30 μL，点于同一薄层板上，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)展开，取出，晾干，在碘蒸气中显色后，置于紫外光灯254 nm处检视，结果见图3，猪肉、羊肉样品色谱图中，在与对照品溶液相应的位置上，显相同颜色的斑点。

图3 薄层系统验证色谱图

1.盐酸克伦特罗对照品溶液；2.莱克多巴胺对照品溶液； 3.沙丁胺醇对照品溶液；4.硫酸特布他林对照品溶液；5.混合对照品溶液；6.空白猪肉样品溶液；7.盐酸克伦特罗猪肉样品溶液；8.莱克多巴胺猪肉样品溶液；9.沙丁胺醇猪肉样品溶液；10.硫酸特布他林猪肉样品溶液；11.混合猪肉样品溶液；12.空白羊肉样品溶液；13.盐酸克伦特罗羊肉样品溶液；14.莱克多巴胺羊肉样品溶液；15.沙丁胺醇羊肉样品溶液；16.硫酸特布他林羊肉样品溶液；17.混合羊肉样品溶液

Fig.3 TLC verification chromatogram

1.clenbuterol hydrochloride standard solution；2.ractopamine standard solution；3.salbutamol standard solution；4.terbutaline sulfate standard solution；5.the mixed standard solution；6.blank pork sample solution；7.spiked pork samples solution(clenbuterol hydrochloride)；8.spiked pork samples solution(ractopamine)；9.spiked pork samples solution(salbutamol)；10.spiked pork samples solution(terbutaline sulfate)；11.spiked pork samples solution(mixed)；12.blank mutton samples solution；13.spiked mutton samples solution(clenbuterol hydrochloride)；14.spiked mutton samples solution(ractopamine)；15.spiked mutton samples solution (salbutamol)；16.spiked mutton samples solution(terbutaline sulfate)；17.spiked mutton samples solution (mixed)

3 实际样品的测定

购于西安市不同农贸市场的2批猪肉和2批羊肉，采用已建立的TLC对该样品进行检测，结果表明，有1批猪肉样品中含有盐酸克伦特罗，其他均未发现盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林。

4 讨论

4.1 固定相的选择实验中采用硅胶G、硅胶GF254和硅胶HPGF254分别制备薄层板，并用其对盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林混合对照品溶液以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)作为展开剂展开，在碘蒸气中熏蒸后，置于紫外光灯中检视，使用硅胶G作为固定相时无法观察到明显的斑点，使用硅胶GF254作为固定相时，斑点有拖尾现象，而使用硅胶HPGF254展开效果良好，且所得斑点清晰，因此选用硅胶HPGF254作为固定相。

4.2 展开剂的选择实验中通过优化展开剂的方法同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林，考察了乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)、浓氨溶液-水-异丙醇(4∶16∶5)和异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)这3种展开剂对目标化合物的展开效果，结果表明，以异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)作为展开剂可以同时检测上述4种目标化合物，且分离效果良好，因此选用异丙醇-环己烷-甲酸(13∶10∶1)作为本实验的展开剂。

4.3 检视方式的选择实验在3种检视条件下(紫外光灯254和366 nm及可见光)进行检视，可见光下无法观察到明显斑点，366 nm处沙丁胺醇显蓝色斑点，其他的斑点颜色不明显，在紫外光灯254 nm处可观察到明显的斑点，另外碘蒸气熏蒸后可明显提高莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林检测方法的灵敏度，故选择碘蒸气熏蒸后在紫外光灯254 nm处进行检视。

本研究建立的TLC方法具有灵敏度高、专属性强、结果准确可靠、操作简单、不需要特殊的设备等特点。可同时对生物样品中的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林4种β2受体激动剂进行现场快速检测，为食品安全快速检测提供了理论依据。

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Establishment and application of thin layer chromatography method for rapid detection of 4 kinds of β2agonists in food

HAN Ningjuan1，2，DU Wei1，CHANG Chun1，FU Qiang1*

(1.School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061， China；2.Xi′an Peihua College，Xi′an 710125， China)

β2agonists；rapid analysis； thin layer chromatography (TLC)

国家自然科学基金项目(编号：81573391和81503034)：陕西省卫生厅科研资助项目(编号：2014D73)

韩宁娟，女，在读硕士研究生