高效液相色谱法测定白驳丸中4种重楼皂苷含量

孔 燕，陈 伟，江国荣*

(1.徐州市中医院，徐州 221009;2.苏州市中医医院,苏州市吴门医派研究院，苏州 215009)



高效液相色谱法测定白驳丸中4种重楼皂苷含量

孔 燕1，陈 伟2，江国荣2*

(1.徐州市中医院，徐州 221009;2.苏州市中医医院,苏州市吴门医派研究院，苏州 215009)

目的 建立高效液相色谱法测定白驳丸中4种重楼皂苷的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1，检测波长203 nm。结果 4种重楼皂苷质量浓度在18.12～465.9 μg·mL-1范围内呈良好线性关系(r=0.999 9)；平均回收率在95.11%～99.74%之间；RSD值均小于3.0%。结论 该方法灵敏度高、准确性好、具有较好的重复性和稳定性，可用于白驳丸的质量控制。

重楼皂苷；白驳丸；高效液相色谱法；含量测定

A.stract:Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 polyphyllins in Baibo Pills. Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18Column， gradient eluted with acetonitrile-water solution， the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL·min-1， UV detection wavelength was set at 203 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.Results 4 polyphyllins showed good linearity within the tested concentration scope(18.12-465.9 μg·mL-1，r=0.999 9)；the method was validated and the recoveries of 4 polyphyllins were 95.11%～99.74%；RSD<3.0%. Conclusion This method is simple， accurate and reproducible，and can be used for the quality control for Baibo Pills.

白驳丸为徐州市中医院皮肤科常用制剂，具有补肾健脾、养血通络、祛风退斑的作用；已在临床使用多年，对白癜风、脂溢性脱发有显著的疗效。白驳丸组方药味较多，主要由重楼等中草药复方组成， 成分比较复杂。重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var．yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz. 或七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var．chinensis(Franch.)Hara 的干燥根茎[1-2]；味苦，微寒，有小毒；归肝经；清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊，主要用于疗疮痈肿[3]，是一种临床常用的皮肤科用药。重楼主含甾体皂苷类成分，约占化合物总含量的80%[4]。

为有效监测该制剂的产品质量，本研究采用高效液相色谱法测定重楼中4种皂苷含量，所得定性、定量分析方法可客观地反映本制剂的内在品质，为白驳丸的质量控制和评价指标提供了理论依据[5-7]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters e2695-2998，PDA检测器，Empower 3色谱工作站)；Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；电子天平(Sartorius公司， BP115D，d=0.1 mg)；高速离心机(美国Thermo公司)；超声波清洗仪(KQ-400GKDV，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙腈(Sigma-Aldrich公司，色谱纯)；去离子水(Milli-Q超纯水机制备，美国Millipore公司生产)。4种重楼皂苷对照品：重楼皂苷Ⅰ(批号201103)、重楼皂苷Ⅱ(批号201103)、重楼皂苷Ⅵ(批号201203)和重楼皂苷Ⅶ(批号201303)，均购自中国食品药品检定研究院。9批白驳丸，批号：150322，150418，150605，150703，150812，150917，151008，20151123，151212，均由徐州市中医医院制剂部生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为35 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱[8-9]:0～40 min A 30%～60%,40～50 min A 60%～30%;流速为1.0 mL·min-1；检测波长为203 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取4种重楼皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL分别含重楼皂苷Ⅰ0.39 mg、重楼皂苷Ⅱ0.36 mg、重楼皂苷Ⅵ 0.47 mg和重楼皂苷Ⅶ 0.39 mg的混合溶液，即得对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取白驳丸适量，研细，混匀，精密称取1 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 空白溶液 以相应的溶剂为空白溶液，即得。

2.3 系统适用性实验 取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，按照2.1项下条件进行检测，4种重楼皂苷色谱峰分离度良好，空白无干扰，色谱图见图1。重楼皂苷Ⅶ对照品峰的理论板数为63 966，主峰和杂质分离良好，分离度为14.8，拖尾因子0.87。

图1 HPLC图

A.空白；B.对照品；C.白驳丸样品20150605；1.重楼皂苷Ⅵ；2.重楼皂苷Ⅶ；3.重楼皂苷Ⅱ；4.重楼皂苷Ⅰ

Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL，分别置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，进样10 μL，按照2.1项下色谱条件进样，测定峰面积。分别以重楼皂苷质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。将上述对照品溶液再稀释后进样，根据峰高以信噪比S/N=3确定检出下限，S/N=10确定定量下限。结果见表1。

表1 4种重楼皂苷线性关系

Tab.1 The linearity relationship of 4 polyphyllins

对照品回归方程r线性范围/μg·mL-1检出下限(S/N3∶1)/μg·mL-1定量下限(S/N10∶1)/μg·mL-1重楼皂苷ⅠY=6847X-348650.999919.71～394.26.5719.71重楼皂苷ⅡY=5926X-247030.999918.12～362.46.0418.12重楼皂苷ⅥY=4808X-272920.999923.30～465.97.76623.30重楼皂苷ⅦY=9859X-414340.999919.33～386.66.44319.33

2.5 精密度实验 取批号20150605样品的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，计算4种重楼皂苷进样精密度，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ 的RSD值分别为1.76%,1.22%，0.89%和1.04%，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取批号20150605样品的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别于0，4，6，8，12和24h进样，测定峰面积，计算4种重楼皂苷的稳定性，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的RSD值分别为1.11%，1.26%，1.89%和0.98%，说明样品在24h内稳定。

2.7 重复性实验 精密称取批号20150605样品6份，每份1g，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，计算4种重楼皂苷含量，其RSD值在0.77%～1.54%之间，说明方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取已测得含量的批号为20150605的样品6份，各0.5g，分别置于25mL量瓶中，精密加入2.2.1项下混合重楼皂苷对照品溶液2.0mL，加甲醇适量，按照2.2.2项下方法制备溶液，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，计算回收率和RSD值，结果见表2。

表2 4种重楼皂苷加样回收率

Tab.2 The recovery of 4 polyphyllins(n=6)

2.9 样品测定 取白驳丸样品9批，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定4种重楼皂苷含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

Tab.3 The results of content of 4 polyphyllins in Baibo Pills(mg·g-1)

3 讨论

白驳丸是笔者所在医院的临床常用药，主要由蒺藜、红花和重楼等中药组方而成。目前尚未制定对该制剂快速有效的质量控制方法。重楼是白驳丸中有小毒的主要药材，选定重楼中的主要成分进行含量测定，并建立稳定可靠的质量控制方法比较符合制剂的质量标准研究思路。

由于中药复方中成分众多，等度洗脱难以充分分离，所以采用梯度洗脱的方法。选用AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，采用梯度洗脱方法，比较了不同流动相系统乙腈水溶液、甲醇水、乙腈醋酸水溶液。结果表明，乙腈水溶液系统优于其他流动相系统，故选用乙腈水溶液流动相系统作为本制剂指纹图谱流动相系统。

对样品处理方法进行比较。采用甲醇与水超声提取，比较了甲醇的不同体积分数(20%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%)、不同提取方法(超声、加热回流、浸渍等)以及不同超声时间(5，10，15，20，30，40，50和60min)。结果表明，甲醇优于水；对不同提取方法进行比较，结果表明，超声提取峰面积大、时间短；对不同超声时间进行比较，结果表明，甲醇超声30min以后，重楼4种皂苷各个峰的面积不增加。综合上述各因素，选择体积分数为70%的甲醇超声30min。

对不同柱温与流速进行比较，柱温超过或低于35 ℃，色谱峰分离度小；流速高于或低于1.0mL·min-1，色谱峰分离度差。因此，选择便于控制的柱温35 ℃与流速1.0mL·min-1。

本文建立了重楼4种皂苷含量测定方法，精密度、稳定性、重复性均符合要求。上述方法为制定白驳丸质量标准提供了理论依据。

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Content determination of 4 polyphyllin in Baibo Pills by HPLC

KONG Yan1，CHEN Wei2，JIANG Guorong2*

(1.Xuzhou Hospital of Chinese Medicine，Xuzhou 221009，China；2.Suzhou Hospital of Chinese Medicine，Suzhou Academy of Wumen Chinese Medicine，Suzhou 215009，China)

polyphyllin；Baibo Pills；HPLC；content determination

reference substances；C.Baibo Pills；1.polyphyllinⅥ；2.polyphylli Ⅶ；3.polyphyllinⅡ；4.polyphyllinⅠ

国家自然科学基金青年项目(编号：81303276)

孔燕，女，副主任中药师

*通信作者：江国荣，男，主任中药师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.008

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0578-03

2016-05-25)