克伦特罗在猪尿液中的消除规律研究

张　倩，颜显辉，管恩平，唐正浩（. 黄岛出入境检验检疫局，山东青岛　66444；. 荣成出入境检验检疫局，山东荣成　6400；. 烟台龙大食品有限公司，山东烟台　64000）

克伦特罗在猪尿液中的消除规律研究

张倩1，颜显辉2，管恩平1，唐正浩3
（1. 黄岛出入境检验检疫局，山东青岛266444；2. 荣成出入境检验检疫局，山东荣成264300；3. 烟台龙大食品有限公司，山东烟台264000）

[目的]研究克伦特罗在猪尿液中的消除规律。[方法]用含有克伦特罗1.5 mg/kg的饲料，饲喂一组体重约50 kg的90日龄育肥猪，正常饲喂35天后停药，收集停药后前32天的猪尿液，采用高效液相色谱法（HPLC）进行克伦特罗含量分析。[结果]停药后的前4天，猪尿液中的克伦特罗浓度迅速下降，第4天降至13.23 µg/kg，之后消除速度放慢，第32天为0.44 µg/kg，仍然高于最低检测限0.05 µg/kg。[结论]克伦特罗在猪体内消除缓慢，容易蓄积。

克伦特罗；猪；尿液；消除

克伦特罗（Clenbuterol），分子式为C12H18Cl2N2O，俗称“瘦肉精”，是一种人工合成的β2-肾上腺受体激动剂。动物大剂量食用克伦特罗可以促进其生长并且提高瘦肉率，人类食用了含“瘦肉精”的猪肉极易中毒[1-3]。1997年，我国出台了《关于严禁非法使用兽药的通知》，禁止使用克伦特罗作为饲料添加剂[4]，但部分养殖户受经济利益驱使，仍然在饲料中非法添加克伦特罗来提高瘦肉的出成率。

本试验参照国内外有关文献报道[5-6]，结合试验的实际需求，限定饲料中克伦特罗含量为1.5 mg/kg，建立了生猪体内克伦特罗的消除模型，采集猪尿液作为监控样本，采用高效液相色谱法（HPLC）提取尿液中的克伦特罗，研究停药后克伦特罗在猪尿液中的变化规律，为通过尿液监控克伦特罗的非法使用情况提供理论依据。

1　材料与方法

1.1仪器

超高效液相质谱联用仪（Aglent1290+6490标配），购自美国安捷伦公司；超声波清洗机，购自昆山市超声仪器有限公司；低速冷冻离心机，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；电子天平，购自长沙湘平科技发展有限公司（ZJ000832）；漩涡混和器，购自上海精科实业有限公司。

1.2材料

盐酸克伦特罗标准品（Sigma）；盐酸克伦特罗-D9内标（Dr.Ehrenstorfer GmbH）；β-葡萄糖醛酐霉/芳基硫酸酯酶；碳酸钾（分析纯，科密欧）；氯化钠（分析纯，科密欧）；乙酸乙酯（分析纯，Merck）；异丙醇（分析纯，科密欧）；甲醇（色谱纯，Merck）；甲酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；乙腈（色谱纯，Merck）；无水硫酸钠（分析纯，科密欧）。

1.3工作储备液和标准工作液的配制

71.6 mg/L标准储备液：准确称取7.54 mg盐酸克伦特罗标准品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，经计算浓度为71.6 mg/L。标准工作液：取上述储备液用定溶液稀释至适当浓度的标准工作液备用。

1.4动物实验及样本的采集

选16头3月龄健康三元猪，每头体重约50 kg，饲喂含盐酸克伦特罗1.5 mg/kg的饲料，自由采食和饮水。35天后换喂不含盐酸克伦特罗的常规饲料，饲喂32天后结束试验。试验分别在用药后第35天和停药后第32天采集试验猪尿样，检测克伦特罗含量。在停药后第32天，将试验猪全部宰杀，采集猪肉（包括前腿肌、背最长肌、后腿肌、肋条五花肉）和皮下脂肪，制作成样本，检测克伦特罗含量[7]。

1.5样品制备

取1 mL尿液于50 mL离心管中，加入8 mL乙酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH 5.2）充分混匀，再加50 µL β-葡萄糖醛酐霉/芳基硫酸酯酶混匀，37 ℃水浴水解12 h。添加内标工作液，加盖涡旋混合15 min，离心10 min（5 000 r/min），取4 mL上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL混匀，用高氯酸调节pH值到（1±0.3），5 000 r/min离心10 min后移取清液至另一离心管中，用10 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到11，各加入10 mL饱和氯化钠溶液和异丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，充分提取，5 000 r/min离心10 min。转移全部有机相，40 ℃减压浓缩干。加入5 mL乙酸钠缓冲液，混匀、溶解后备用。将上述残渣溶液过预先用3 mL甲醇、3 mL水活化的上柱，然后依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗涤柱子并彻底抽干，最后用2 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱子上的待测成分。流速控制在0.5 mL/min。用40 ℃ 氮气吹干洗脱液，加入定容液振荡溶解残渣，离心后清液过滤膜，供液相色谱-质谱测定。

1.6色谱质谱条件

色谱条件：ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱（2.1×100 mm×1.8 µm）；流速为0.4 mL/min；进样量为2 µL；柱温：30 ℃；流动相A为甲醇，B为0.1% 甲酸（含5 mmol/L乙酸铵），梯度洗脱（表1）。质谱条件：干燥气温度为220 ℃；干燥气流速为15 L/min；雾化气压力为20 psi；鞘气温度为350 ℃；鞘气流速为12 L/min；毛细管电压为2 200 V；扫描模式为MRM，母离子、监测离子、碰撞能量和锥孔电压等MRM参数见表2。

表1　梯度洗脱程序

表2　克伦特罗及克伦特罗内标的质谱参数

1.7数据处理与计算

1.7.1定性测定。如果检测的色谱峰与标准品色谱峰的保留时间一致，且离子峰度比满足要求，视为检出。

1.7.2定量测定。样品浓度如超出线性范围，则采取减小称样量的方法，使其检测浓度在线性范围内。

1.7.3检测限度。克伦特罗0.05 µg/kg。

1.7.4计算公式。采用内标法定量，按下列公式计算克伦特罗残留量：。公式中：X—试样中待测组分残留量（µg/kg）；C—标准工作溶液浓度（ng/mL）；Csi—标准工作溶液中内标物浓度（ng/mL）；Ci—样液中内标物浓度（ng/mL）；As—标准工作溶液峰面积；A—样液中待测目标物峰面积；Asi—标准工作溶液中内标物峰面积；Ai—样液中内标物峰面积；V—样品定容体积（mL）；W—样品称样量（g）。

2　结果

克伦特罗投喂至第35天，猪尿液样本中的克伦特罗浓度为239.23 µg/kg。由图1可以看出，停药期前4天猪体内克伦特罗消除速度最快，停药后第1天（即停药后24小时）尿液中克伦特罗浓度由239.23 µg/kg降到103.45 µg/kg，第4天浓度已降至13.56 µg/kg。之后克伦特罗在猪体内的消除速度放慢。停药后第32天浓度为0.44 µg/kg，仍然高于克伦特罗最低检出限0.05 µg/kg。停药后第32天，猪肉和脂肪中克伦特罗含量已低于0.05 µg/kg。

图1　停药期猪尿液中克伦特罗消除规律

3　讨论

猪摄入的克伦特罗排出体外的主要途径是通过尿液。Smith[8]通过14C-克伦特罗对克伦特罗在猪尿液、粪便、屠体和内脏中的分布进行了研究，发现阉猪和母猪中14C-克伦特罗的总回收率分别是95.1%和99.3%。尿液中14C-克伦特罗排泄比率最大，可以达到55%～75.4%，粪次之。猪停药24小时后，尿液中克伦特罗浓度由239.23 µg/kg降到103.45 µg/kg，停药后第4天浓度已降至13.56 µg/kg，证明了猪体内的克伦特罗主要通过尿液排出体外。

试验中猪停药32天后仍可以在尿液中检出克伦特罗残留，并且检测值远远大于克伦特罗的最低检出限0.05 µg/kg，说明克伦特罗被动物摄入体内后至完全消除是一个十分缓慢的过程。此时，猪肉和脂肪中的克伦特罗含量已经低于检测限，说明克伦特罗在猪肉和脂肪中的消除速度比在尿液中快，因此以猪尿液作为克伦特罗的监控样本具有较高的灵敏性。至于尿液中克伦特罗消除速度缓慢的原因，是否是机体内有其他组织在缓慢蓄积克伦特罗并释放进入尿液，还有待进一步研究。

克伦特罗作为一种β2-受体激动剂，可以与呼吸道细胞膜上广泛分布的β2-受体结合，也能够使得机体其它部位的β2-受体兴奋，如血管平滑肌、骨骼肌和子宫等[9]。给猪食用克伦特罗，能提高猪肉的瘦肉率，但是提高猪肉的瘦肉率不是克伦特罗本身具有的药理作用，其使用剂量必须为治疗剂量的数十倍时才会表现“提高瘦肉率”的效果。肖日进等[10]研究表明，不同添加水平的克伦特罗能够不同程度地提高猪胴体瘦肉率，其中以添加15 mg/kg克伦特罗的效果最为显著。杨志凌等[11]与李慧等[12]在克伦特罗的研究中，将仔猪饲料中克伦特罗的添加含量设定为5 mg/kg和10 mg/kg，本试验中克伦特罗的给药含量为1.5 mg/kg，远低于以上添加数值和实际中的非法添加剂量，其蓄积期残留含量也相对要低一些，而在停药32天后却仍然可以从猪尿液中检出克伦特罗，并且检测值远远高于最低检测限。

从本试验可以看出，克伦特罗在猪尿液中的消除速度十分缓慢，残留时间可达30天以上，而克伦特罗通常被非法用于育肥猪后期生长阶段，即出栏前一个月左右，因此以猪尿液作为样本监控克伦特罗的非法使用情况是一种非常有效的监管手段。

[1] Sauern M J，Pickett R J H，Limer S，et al. Distribution and elimination of clenbuterol in tissues and fluids of calves following prolonged oral administration at a growpromoting dose[J].J Vet Pharmacol Therap，1995（18）：81-86.

[2] 王立斌，张永慧，等. 盐酸克伦特罗引起特大食物中毒的调查与思考[J].华南预防医学，2002，28（1）：54-56.

[3] Salleras L，Domiguez A，Mata E，et al. Epidemiologic study of an uoutbreak of clenbuterol poisoning in Catalonia[J]. Spain Public Health Rep，1995，110（4）：338-341.

[4] 农业部.关于严禁非法使用兽药的通知：农牧发3号[EB/OL].（1991-03-25）[2016-11-09].http://www.moa.gov.cn/ zwllm/zcfg/qtbmgz/200601/t20060120_539531.htm.

[5] 王开雄，何天武，刘琴. 盐酸克伦特罗在动物体内代谢与残留规律[J].上海畜牧兽医通讯，2007（4）：52.

[6] Jelka P，Ana V. Clenbuterol residues in pig muscle after repeat administration in a growth-promoting dose[J]. Meat Science，2010（1）：733-737.

[7] 王凤美，张鸿伟，庞士平，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品和尿液中4种β-受体激动剂残留[J].分析化学，2008，36（12）：1629-1635.

[8] Smith D T，万美梅，谭滇湘.14C-盐酸克伦特罗混饲在猪体内的残留消除研究[J].中国动物保健，2003（23）：9-12.

[9] 杨诗兴．应用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂饲喂家禽对消费者的安全问题[J].动物营养学报，2001，13（3）：14-18．

[10] 肖日进，许梓荣. Clenbuterol对肥育猪作用效果的研究[J].浙江农业大学学报，1995，21（3）：227-231.

[11] 杨志凌，陈杖榴，方炳虎，等.高效液相色谱-电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗[J].色谱，2003，21（3）：245-247.

[12] 李慧，刘士杰，苏晓欧. 盐酸克伦特罗在猪尿液中消长动态研究[J].中国畜牧兽医，2005，32（9）：35-36.

（责任编辑：杜宪）

Study on Elimination Rule of Clenbuterol in Swine Urine

Zhang Qian1，Yan Xianhui2，Guan Enping1，Tang Zhenghao3
（1. Huangdao Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong266444；2. Rongcheng Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Rongcheng，Shandong264300；3. Yantai Longda Foodstuffs Co.，Ltd.，Yantai，Shandong264000）

[Objective] In order to study the elimination rule of Clenbuterol in swine urine. [Methods] A group of 50 kg，90-day-old fattening pigs were fed on feed containing Clenbuterol of 1.5 mg/kg，the experiment of feeding drugs was conducted for 35 days totally. After drug withdrawal，the prior 32-day swine urine samples were collected and the content of Clenbuterol was analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）. [Results] The concentration of Clenbuterol in the urine dropped down quickly in 1～4 days after drug withdrawal，and in the fourth day，it was down to 13.23 µg/kg，then the elimination rate slowed down and in the thirty-second day，it was 0.44 µg/kg，which was still higher than the minimum detection limit of 0.05 µg/kg. [Conclusion] The results showed that Clenbuterol eliminated slowly and accumulated easily in pigs.

Clenbuterol；swine；urine；elimination

S851.43

B

1005-944X（2016）12-0031-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.009

国家质量监督检验检疫总局科学研究和技术开发项目（2011IK189）