HPLC法测定葛花中大豆苷和染料木苷的含量

徐桂新，张转平，谭华森

(安康市食品药品检验检测中心，安康 725000)



HPLC法测定葛花中大豆苷和染料木苷的含量

徐桂新，张转平，谭华森

(安康市食品药品检验检测中心，安康 725000)

目的 建立HPLC法测定葛花中大豆苷、染料木苷的含量。方法 采用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-1.0 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为260 nm；柱温为30 ℃。结果 大豆苷回归方程为Y=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，大豆苷在0.206～1.032 μg范围内线性关系良好；染料木苷回归方程为Y=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，染料木苷在0.204～1.018 μg范围内线性关系良好。结论 该方法简便、准确，重复性好，可作为葛花的质量评价依据。

葛花；大豆苷；染料木苷；HPLC

A.stract:Objective To establish an HPLC method for the determination of the content for daidzin， genistin glycosides in the flower of kudzuvine. Methods C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used with acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (15∶85) as the mobile phase；the flow rate was 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was 260 nm，and the column temperature was 30 ℃. Results Daidzin regression equation wasY=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，indicated that daidzin injection amount between 0.206-1.032 μg had good linear relationship；genistein glycosides regression equation wasY=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，showed that genistein glycosides injection amount between 0.204-1.018 μg had good linear relationship. Conclusion The method is simple，accurate，reproducible，and can be used as a quality assessment method for the flower of kudzuvine.

葛花为豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥花。现代研究表明，葛花中含有黄酮、皂苷、挥发油等成分，具有保肝、解酒、保护心肌、降血糖、降血脂等药理活性[1-3]。其中黄酮类成分有延缓女性衰老、改善更年期症状、预防癌症及心血管疾病等功效[4-6]。笔者以大豆苷、染料木苷[7]为指标性成分进行实验，取得了较为满意的结果，所建立的方法操作简便、快速，重复性好，可作为葛花的质量评价依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC Solution色谱工作站；KQ-250D超声波清洗器(天津奥特赛恩斯有限公司)。

1.2 试药 大豆苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号11738-200501)；染料木苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号111709-200501)；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Kromasil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-1.0 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为260 nm；柱温为30 ℃。在上述色谱条件下，样品中2种成分与其他组分分度较好，结果见图1。

图1 HPLC图

A.大豆苷对照品；B.混合对照品；C.葛花样品；1.大豆苷；2.染料木苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A. daidzin solution；B. daidzin and genistin glycosides mixture solution； C.flower of kudzuvine solution；1.daidzin；2.genistin glycosides

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取大豆苷、染料木苷对照品适量，加甲醇制成1 mL约含0.05 mg的混合溶液，即得。

2.3 供试品提取条件考察和制备

2.3.1 提取溶剂的选择 取同一样品适量，精密称定，加入体积分数分别为30%的甲醇、50%的甲醇、80%的甲醇和甲醇20 mL，加热回流30 min，回流的样品取续滤液测定含量，结果见表1。从测定结果看，体积分数为80%的甲醇提取效果最佳，故选用体积分数为80%的甲醇为提取溶剂。

表1 不同提取溶剂的测定结果

Tab.1 The determination results of different solvents

质量分数/%30%甲醇50%甲醇80%甲醇甲醇大豆苷0.0830.0900.1130.1100.0750.0810.1060.092染料木苷0.0720.0800.0980.0900.0680.0760.090 0.084

2.3.2 供试品溶液的制备 取葛花粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入体积分数为80%的甲醇20 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 精密称取2.2项下的大豆苷、染料木苷混合对照品溶液(大豆苷和染料木苷质量浓度分别为0.051 6 g·L-1和0.050 9 g·L-1)，分别精密吸取4，8，12，16和20 μL，进样，在相同条件下进行测定，以峰面积(Y)对进样量(X)作标准曲线，计算。大豆苷回归方程为Y=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，表明大豆苷在0.206～1.032 μg范围内线性关系良好；染料木苷回归方程为Y=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，表明染料木苷在0.204～1.018 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 精密吸取上述对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件连续进样5次，测定。大豆苷峰面积RSD值为1.02%；染料木苷峰面积RSD值为1.65%。2.6 重复性实验 取同一样品，按照供试品溶液制备方法平行制备5份，依法测定含量。测定结果显示，大豆苷峰面积RSD值为2.18%，染料木苷峰面积RSD值为2.06%。结果表明重复性较好。

2.7 回收率实验 取同一样品6份，分别加入大豆苷1.05 mg、染料木苷对照品0.98 mg，按照供试品溶液制备方法进行处理后，依法测定含量，计算回收率。大豆苷平均回收率为98.27%，RSD值为2.33%；染料木苷平均回收率为99.18%，RSD值为1.51%。结果见表2～3。2.8 含量测定 分别精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10 μL，进样，测定峰面积，计算大豆苷、染料木苷的含量，结果见表4。

表2 大豆苷加样回收率实验

Tab.2 Daidzein sample recovery rate test

取样量/g样品中大豆苷的含量/mg对照品加入量/mg测出量/mg回收率/%平均回收率/%1.03271.2601.052.30699.698.271.00241.2211.052.295102.31.11261.3551.052.37997.51.07261.3061.052.32396.91.04621.2741.052.29597.21.07681.3121.052.32196.1

表3 染料木苷加样回收率实验

Tab.3 Genistin glycosides sample recovery rate test

取样量/g样品中染料木苷的含量/mg对照品加入量/mg测出量/mg回收率/%平均回收率/%1.03271.0330.982.00599.299.181.00241.0020.981.998101.61.11261.1130.982.07598.21.07261.0730.982.054100.11.04621.0460.982.01298.61.07681.0770.982.03297.4

表4 葛花中大豆苷、染料木苷的测定结果

Tab.4 Daidzein and genistein glycosides determination result in the flower of kudzuvine

产地送样时间大豆苷/%染料木苷/%镇坪2010-09-150.1220.100镇坪2010-09-200.1020.088平利2010-11-020.1230.111平利2010-11-050.2070.134旬阳2010-11-080.0580.047

3 讨论

3.1 溶剂的选择 不同体积分数的甲醇对葛花异黄酮的提取有明显影响，从实验结果看，用体积分数为80%的甲醇提取测定结果略高于其他溶剂，故采用体积分数为80%的甲醇为提取溶剂。

3.2 流动相的选择 分别用甲醇-水(30∶70)和乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)为流动相进行实验，结果发现后者图谱中峰分离效果及峰形均优于前者，故选用乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)为流动相。

3.3 结果分析 从上述实验结果来看，各样品中大豆苷、染料木苷的含量均有差异，可能与生长环境及采收时期有关，因葛花花期较短(10 d左右)，采收时间有待进一步考察。本文所建立的方法操作简便、快速，重复性好，可作为葛花的质量评价依据。

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Determination of daidzin and genistin glycosides in the flower of kudzuvine by HPLC

XU Guixin，ZHANG Zhuanping，TAN Huasen

(Ankang Inspection and Testing Center of Food and Drug，Ankang 725000，China)

flower of kudzuvine；daidzin；genistin glycosides；HPLC

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.006

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0571-03

2016-03-21)