知柏地黄汤对解脲脲原体感染模型大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达的影响*

宾东华何清湖韩 忠陈虹历李迎秋刘朝圣

1. 湖南中医药大学（湖南 长沙 410208）；2. 湖南中医药大学第一附属医院

知柏地黄汤对解脲脲原体感染模型大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达的影响*

宾东华1，2何清湖1**韩 忠1陈虹历1李迎秋1刘朝圣1

1. 湖南中医药大学（湖南 长沙 410208）；2. 湖南中医药大学第一附属医院

目的 研究知柏地黄汤对解脲脲原体（UU）感染模型大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达的影响。方法 取体质量为（220±10）g 雄性SD大鼠80只，随机分成假手术组、模型组、中药组（知柏地黄汤）、西药组（强力霉素）、中西药组（知柏地黄汤+强力霉素），造模成功后，假手术组与模型组给予等量的生理盐水灌胃，治疗组（中药组、西药组和中西药组）给予相应的药物灌胃，连续用药21d。末次给药24h后取标本，采用常规精液检测法检测精液质量，RT-PCR法检测精子NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达。结果 假手术组、模型组、中药组、西药组、中西药组大鼠精子NADH脱氢酶mRNA表达水平分别为0.44750±0.017078、0.24750±0.015000、0.34250±0.017078、0.36500±0.012910、0.39400±0.012100；ATP合成酶mRNA表达水平分别为0.36500±0.012910、0.27250±0.009574、0.35250±0.018930、0.34750±0.017078、0.39500±0.012910；直线速度分别为（12.93±1.08）μm/s、（6.24±1.13）μm/s、（12.78±0.92）μm/s、（10.43±1.32）μm/s、（13.54±1.16）μm/s；平均速度分别为（20.32±2.08）μm/s、（12.48±3.54）μm/s、（20.48±2.16）μm/s、（17.12±3.15）μm/s、（21.72±1.83）μm/s。中西药组NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平与模型组、中药组、西药组比较均有上升，差异均有统计学意义（P＜0.01），中西药组精子运动速度与模型组、中药组、西药组比较均上升，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 UU感染大鼠模型精子运动速度及NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平变化，提示其可能是UU感染所致不育症的机制之一。

知柏地黄汤； 解脲支原体； 精子； NADH脱氢酶； ATP合成酶

目前不孕不育已经成为一个重大的公共卫生问题，日益受到政府与医学界的重视。在各种不育因素中，男性因素约占30%～50%［1］，生殖道感染是男性不育的重要危险因素，而解脲脲原体（UU）的感染率最高［2］。研究表明，男性生殖道UU感染可致生精细胞内出现空泡化线粒体，干扰精子的发生及成熟，从而引起精子数目减少、活力下降、畸形率增加及膜破损等微结构变化，进而导致不育［3］。精子中段的线粒体鞘，通过氧化磷酸化合成ATP，在精子运动过程中为精子尾部鞭毛供给所需能量［4］，精子线粒体能量合成障碍将降低精子活力及受精能力。线粒体氧化磷酸化的电子传递链主要由多个复合蛋白体组成，复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等［5］。NADH脱氢酶（复合酶Ⅰ）是线粒体呼吸链的起始酶，在线粒体呼吸链中扮演着重要的角色，为氧化磷酸化-电子呼吸链的入口点，2个电子从NADH进入电子传递链，伴有线粒体基质中释放的4个质子，再通过复合酶Ⅲ、Ⅳ的协作，完成10个质子的跨膜易位，最终为ATP合成酶（复合酶Ⅴ）合成ATP提供动力［6，7］。

本文在以往UU感染导致男性不育患者的精子活力下降的临床观察研究基础［8］之上，为了进一步探讨知柏地黄汤治疗UU感染所致男性不育症的部分机制，我们通过动物实验的方法检测知柏地黄汤对UU感染大鼠精子质量及NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平的影响来揭示其部分治疗机制，现报道如下。

材料与方法

一、材料

（一）实验动物

SPF级12～14周龄雄性SD大鼠80只，体质量（220±10）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，［实验许可证号：SCXK（湘）2013-0004］，常规饲养。

（二）主要试剂与药物

TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）、NADHmRNA、ATPmRNA引物（生工生物工程股份有限公司）。解脲脲原体（UU）标准株由南华大学微生物学教研室提供，将UU标准菌株（冻干品）复苏，接种，体外实验用效价为10×106ccu/mL的菌液。

知柏地黄汤（熟地黄24g、淮山药12g、山萸肉12g、茯苓（不去皮）9g、泽泻9g、牡丹皮9g、盐知母6g、盐黄柏6g），药物炮制及用量基本按《医宗金鉴》所载执行。按以上用药比例在湖南中医药大学第一附属医院中药房购买药材，采用水煎后制备成0.94g生药/mL煎剂备用。强力霉素（盐酸多西环素片，江苏联环药业股份有限公司，国药准字号：H32021266），0.1g/片，临用时用灭菌注射用水配成含强力霉素2mg/mL浓度的混悬液。

（三）实验仪器

ABI-7300型PCR扩增仪（美国，ABI公司）、组织匀浆机（FLUKO，PRO200），核酸蛋白分析仪，蜗旋震荡器（青浦泸西仪器厂、K30），台式微量离心机等。

二、方法

（一）模型建立

（2）造成财政资源浪费。安排财政专项，是基于各部门要完成特定的任务，如果项目执行进度慢，资金一直“趴在”账上不动，资金的使用效益就无从谈起，从另一个方面也反映了相关部门任务没完成，要不钱怎么会“花”不出去，影响高校事业的健康发展。到年底，为了完成进度，必然盲目突击花钱，资金没用在“刀刃”上，造成了财政资金的浪费。

参照李楠等［9］造模方法。从80只SD大鼠中随机抽取65只，建立UU感染动物模型，余下15只注射生理盐水。于接种后的第10天随机取出5只造模大鼠处死，取大鼠附睾剪碎组织液运用培养法检测UU，判断造模成功否。

（二）动物分组与给药

动物造模成功后，随机分为模型组（知柏地黄汤）组、西药（强力霉素）组、中西药（知柏地黄汤组+强力霉素）组，同时设假手术对照组，每组15只大鼠。各治疗组给相应药物灌胃，假手术组、模型对照组给等量生理盐水灌胃，每日2次。知柏地黄汤组给药量为（8.56g生药/kg·d-1）（按体表面积计算相当60 kg成人用量），强力霉素组给药量为（20mg/kg·d-1），中西组给予等量的知柏地黄汤与强力霉素。各组均连续灌胃21d。

（三）取材与指标检测

1. 精子悬液制备及精子活力检测：颈椎脱臼处死老鼠后，无菌操作取一侧附睾放入盛有5mL已预热至37℃PBS液的无菌玻皿中，剪碎，摇匀，将含有精子的培养皿置37℃ CO2培养箱中，充分扩散5min，制备精子悬液。用PBS液按1：5比例稀释精子悬液，充分摇匀后置于37℃电子显微镜下观察，用×4倍显微摄录相机记录精子运动图像，并用精子动态检测系统进行精子运动参数测定［10］。

2. 精子细胞NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA检测：取精子悬液，按照逆转录试剂盒操作步骤进行，引物序列：从NCBI中下载以下基因序列，引物设计采用Primer 5.0软件，引物序列见表1。

表1　引物序列

（四）统计学处理

结 果

于接种后的第10天随机取出5只造模大鼠处死，取附睾剪碎组织液运用培养法检测UU，5只大鼠均培养出UU，说明造模成功。治疗后处死各组大鼠，取附睾剪碎组织液培养UU，结果显示：假手术组未培养出UU，模型组培养UU阳性率93.3%（14/15），中药组培养UU阳性率33.3%（5/15），西药组培养UU阳性率26.7%（4/15），中西药组培养UU阳性率20%（3/15）。与假手术组比较，模型组UU阳性率高，两组间比较差异具统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，中药组、西药组、中西药组培养UU阳性率均降低，差异均具统计学意义（P＜0.05）。中药组、西药组的UU阳性率与中西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）

二、各组大鼠精子质量及精子运动参数的比较

从表2可看出：与模型组比较，假手术组及各治疗组精子直线速度、平均速度均有上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。与西药组比较，假手术组及中药组和中西药组精子直线速度、平均速度均有上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2　各组大鼠精子运动参数比较（±s，n=15n=15）

表2　各组大鼠精子运动参数比较（±s，n=15n=15）

注：与模型组比较，*为P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.01

组别 　n 直线速度（μm/s） 平均速度（μm/s）假手术组 　15 　12.93±1.08*△　20.32±2.08*△模型组 　15　6.24±1.13　12.48±3.54中药组 　15　12.78±0.92*△　20.48±2.16*△西药组 　15　10.43±1.32*　17.12±3.15*中西药组 　15　13.54±1.16*△　21.72±1.83*△

三、各组大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、mRNA ATP合成酶mRNA表达的比较

从表3、图1可看出：与假手术组比较，模型组及各治疗组精子线粒体NADH脱氢酶mRNA表达水平下降，差异具统计学意义；ATP合成酶mRNA表达水平模型组有下降，而中西药组上升，差异有统计学意义（P＜0.01），中药组和西药组均有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各治疗组线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平均有上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。与中西药组比较，中药组与西药组线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平均下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）。

表　3大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表达水平情况（±s）

表　3大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表达水平情况（±s）

注：与假手术组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；与中西药组比较，△P＜0.01，△△P＜0.05

组别 n 　NADH mRNA　ATP mRNA假手术组 15 　0.44750±0.017078　0.36500±0.012910模型组 15　0.24750±0.015000▲　0.27250±0.009574▲中药组 15　0.34250±0.017078▲*△　0.35250±0.018930*△西药组 　15　0.36500±0.012910▲*△△　0.34750±0.017078*△中西药组 15　0.39400±0.012100▲**　0.39500±0.0012910▲*

图1　NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达

讨 论

精子的运动，特别是快速前向运动能力在男性生殖中具有重要的意义，精子运动能力与精子线粒体的功能密切相关。线粒体作为细胞最重要的细胞器，为生命活动提供基本能量。线粒体是精子运动的供能中心，线粒体的呼吸功能正常与否与精子的运动能力直接相关。线粒体供能主要通过位于线粒体内膜上的5个呼吸链复合酶完成，即：NADH脱氢酶（复合体Ⅰ）、琥珀酸-Q氧化还原酶（复合体Ⅱ）、UQ-细胞色素C氧化还原酶（复合体Ⅲ）、细胞色素C氧化酶（复合体Ⅳ）和ATP合成酶（复合体Ⅴ）［11］。

我们课题组的前期研究发现UU感染可以导致精子质量下降［8］，本次动物实验再次证实UU感染后大鼠精子直线速度及平均速度均有下降，而知柏地黄汤干预后精子质量参数均有改善。我们通过实验研究发现，UU感染后大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平均有下降，两者间可能存在一定的联系，因此，我们猜测引起UU感染所致精子质量下降的内在原因可能是UU感染破坏精子结构，引起大鼠精子线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平下降，精子线粒体呼吸功能受损，ATP生成障碍，精子运动供能降低，从而导致精子的质量发生改变，精子的直线速度及平均速度降低。

中医学认为UU感染性不育（精子活力低下）其病机多以阴虚为本，湿热为标；其病因多为房室不洁或摄养失慎，染及秽浊之毒，侵入前阴，浸淫于上，阻于膀胱，扰及精室，致局部气血运行滞塞，湿热蕴结熏蒸，湿热秽浊之邪缠绵不愈，浊毒久恋，化火伤阴，伐伤肾阴导致肾阴不足，肾精亏虚，无以化阴阳而生精养精，或虚火灼精，使精少、活力低下而不育；本病病位在下焦，以肾阴亏虚为本，湿热为标，病性属虚实夹杂之证，以虚为主，其基本病机为肾阴亏虚，兼有湿热瘀滞。故在临床中运用滋阴补肾、清热利湿、解毒化浊的知柏地黄丸为基本方治疗取得了满意临床疗效。

知柏地黄丸出自《医宗金鉴》，由六味地黄丸加知母、黄柏而成。六味地黄丸之“三补”，即熟地黄滋补肾阴，山茱萸滋肾益肝，山药滋肾补脾，共成三阴并补而以补肾为主。丹皮、茯苓、泽泻为“三泻”，合用以淡渗利湿，苦以燥湿，且泽泻尚能泻肾中之热，利水而不伤阴。加上知母清热泻火、滋阴润燥，与苦寒之黄柏相须为用，更增强了滋肾阴清相火的作用。以上诸药，滋阴补肾，清热利湿，颇合 UU感染性不育肾虚为本、湿热为标之病机，为治疗本病之中医基本方，临证加减每多取效［8，12］。

本实验发现UU感染可导致大鼠精子直线速度、平均速度及线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平均有下降，这可能是UU感染所致男性不育患者精子活力低下的病理机制之一。知柏地黄汤干预后，大鼠精子直线速度、平均速度及线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平均有上升，其中知柏地黄丸+强力霉素组的上升最为明显，且UU感染率明显降低，与模型组比较，有显著性差异，说明中西结合治疗可有效杀灭UU，改善UU感染后大鼠精子质量，提高精子运动能力，上调线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平，增加线粒体ATP的生成，这与以往研究发现精子活力与精子线粒体功能呈正相关性的结论是一致的［13］。

本研究结果表明，知柏地黄汤可能通过增加线粒体NADH脱氢酶mRNA、ATP合成酶mRNA表达水平，提高精子线粒体呼吸功能，增强精子线粒体能量产生，提高精子供能，从而达到提高精子运动能力的目的。

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10 何清湖， 郭炫佐， 郭军华， 等. 知柏地黄汤对解脲支原体感染大鼠生精细胞TRPV1、TRPV5表达的影响. 中国中西医结合杂志 2015； 35（10）：1218-1222.

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12 郭军华， 何清湖. 滋阴补肾法防治男性不育症的实验研究进展. 湖南中医药大学学报 2014； 34（6）： 57-60

13 Ferramosca A， Provenzano SP， Coppola L， et al. Mitochondrial respiratory efficiency is positively correlated with human sperm motility. Urology 2012；79（4）： 809-814

（2016-05-08收稿）

Effect of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum infection*

Bin Donghua1，2， He Qinghu1**，Han Zhong1， Chen Hongli1， Li Yingqiu1， Liu Chaosheng1
1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208， China； 2. The First Affi liated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine
Corresponding author： He Qinghu， E-mail： hqh1111@tom.com； Tel： 13787105021

Objectivee To investigate the effects of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum （Uu） infection. Metthhooddss Total of 80 male SD rats with body mass of （220+10）g were randomly divided into sham operation group，model group， Chinese medicine group （Zhibai Dihuang Decoction）， western medicine group （doxycycline）， western group （Zhibai Dihuang Decoction plus doxycycline）， After rat models were successfully established， rats in the sham operation group and the model group were given equal amount of normal saline， and rats in the treatment groupwere intragastrically given the corresponding medicine， and the drug was administered continuously for 21 days. During 24 hours after the last administration， semen samples were collcetd， and the semen quality was detected by routine semen detection. RT-PCR was used to detect the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase in sperm. Results The expression levels of sperm NADH dehydrogenase in the control group， model group， Chinese medicine， western medicine group， the group of Chinese and western of rat were 0.44750±0.017078， 0.24750±0.015000， 0.34250±0.017078，0.36500±0.012910， and 0.39400±0.012100 respectively； The expression levels of ATP synthetase were 0.36500±0.012910，0.27250±0.009574， 0.35250±0.018930， 0.34750±0.017078 and 0.39500±0.012910 respectively； Linear velocity were（12.93±1.08）μm/s， （6.24±1.13）μm/s， （12.78±0.92）μm/s， （10.43±1.32）μm/s， （13.54±1.16）μm/s； Average speed of（20.32±2.08）μm/s， （12.48±3.54）μm/s， （20.48±2.16）μm/s， （17.12±3.15）μm/s， （21.72±1.83）μm/s. the expression levels of NADH dehydrogenase and ATP synthase in Chinese and western group level were signifi cant increased compared with that in the model group， Chinese medicine group， western medicine group （P＜0.01）， and sperm motility， vitality， motion velocity were also remarkably increased， the differences were statistically signifi cant （P＜0.01）. Conclusionusion The change of sperm motility rate and the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase may be one of the mechanisms of UU infection-caused infertility.

Zhibai Dihuang Decoction； ureaplasma urealyticum； Spermatozoa； NADH dehydrogenase；ATP synthase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.001

R 698.2

资助：国家自然科学基金资助项目（81373641，81603634）；湖南省中医药管理局课题资助项目（2015101）

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，E-mail： hqh1111@tom.com；Tel： 13787105021