运动对非酒精性脂肪肝形成中内质网应激PERK/eIF2a、IRE1/XBP1通路的影响

李军汉 李恩 张仲阳 苏全生

摘 要：观察内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路在非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的变化，探讨运动对非酒精性脂肪肝（NAFLD）的预防作用及作用机理。方法：SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和运动组3 组，每组10只。对照组给予普通饲料喂养，模型组予高脂饲料喂养，运动组在高脂饲料喂养的同时予运动干预，连续8周，直至实验结束。油红O染色观察肝脏病理形态变化，western blot检测PERK、 eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表达。结果：1）与对照组比较，模型组油红O脂滴数量增加，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表达增加；2）与模型组比较，运动组油红O脂滴数量减少，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表达降低。结论：8周高脂饮食可成功复制NAFLD动物模型，内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路参与NAFLD的形成。运动对NAFLD形成具有较好的预防作用，其机制可能与运动可降低PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表达，减少内质网应激有关。

关键词： 内质网应激；非酒精性脂肪肝；运动

中图分类号： G 804.2 文章编号：1009783X（2016）05045904 文献标志码： A

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的病理综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纤维化和脂肪性肝硬化4个病理过程[1]。近年来，NAFLD 发病率呈上升趋势，严重危害人民健康，但其发生机制仍不清楚[2]。研究[34]报道，ERS在心血管、神经元变性和糖尿病等疾病中起着重要作用。有关ERS相关蛋白在NAFLD中的作用机制，国内外仅有少量文献[56]报道。迄今为止，内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途径在NAFLD中的作用尚未见文献报道。本研究拟通过高脂饲料喂养诱导大鼠NAFLD动物模型，并采用运动干预，探讨NAFLD形成中的内质网应激作用机制及运动对NAFLD的干预作用和作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SD雄性大鼠30只，SPF/VAF 级，体重为（195.36±5.87）g，分笼饲养，自由饮食饮水，室温18～22 ℃，相对湿度45%～55%，12 h光照和12 h熄灯模拟昼夜交替。

1.2 分组与喂养

所有大鼠适应性喂养3 d后，随机分为对照组、模型组和运动组，每组10只。对照组给予普通饲料喂养，模型组予高脂饲料喂养，运动组在高脂饲料喂养的同时予运动干预，连续8周，直至实验结束。高脂饲料配方[7]如下：基础饲料71.8%，猪油18%，胆固醇2.0%，胆盐0.2%，蛋黄粉8%。

1.3 运动方法

运动方式参照文献[8]报道，实验前先进行3 d适应性游泳练习，每天1次，每次15 min，每天递增10～20 min，经1周增加至60 min，以后各周都维持此运动量，直至实验结束。训练时驱赶不游泳大鼠，以防漂浮水面。正式运动期间每周运动6 d，每天1次，每次60 min。运动条件：长150 cm×宽60 cm×高70 cm的游泳池，水温（31±1）℃，水深60 cm，超过大鼠身长的2倍。

1.4 样本采集与处理

大鼠处死前先禁食12 h，称重后以2%戊巴比妥钠溶液4 mL/kg腹腔内注射麻醉，新洁尔灭消毒皮肤，以腹部正中切口打开腹腔，迅速取出肝脏，置于4 ℃生理盐水中反复漂洗，在肝左叶中部切取1 cm×1 cm×1 cm，放置于液氮中速冻，转入-80 ℃冰箱储存，用于Western bolt检测。取肝右叶一部分固定包埋，用于冰冻切片和油红O染色。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 油红O染色观察肝脏病理形态

油红O染色方法：肝脏冰冻切片（5 μm厚度）用于脂质染色。脂滴为红色，每张切片在200倍光镜显微镜下随机取5个视野，采用ImagePro plus 6.0图像分析系统进行半定量分析，计算每个视野下红色脂滴光密度，每张切片5个视野下红色脂滴光密度相加后取平均值，用每组平均光密度表示红色脂滴的多少，单位以AIOD.μm2表示。

1.5.2 western blot法测PERK/ eIF2a和IRE1/XBP1途径蛋白表达

将50 mg的冰冻肝组织置于匀浆器中，用剪刀尽量将组织块剪碎，加入500 mL组织裂解液，反复研磨使组织尽量碾碎，30 min的裂解后，以2 000 r/min，4 ℃离心组织匀浆10 min，取上清液，再以12 000 r/min，4 ℃ 离心30 min，回收上清液，取小部分上清液用BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白样品（50 μg）经12.5%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。经5 %脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别用兔单抗PERK（1∶2 000，abcam公司）、兔单抗eIF2a（1∶2 000，abcam公司）、兔单抗IRE1（1∶2 000，abcam公司）、兔单抗XBP1（1∶1 000，abcam公司）和兔单抗βactin（1∶1 000，abcam公司）室温孵育1 h后，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分别加入相应的HRP结合的羊抗兔IgG（1∶2 000，abcam公司）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL发光液，1 min后于暗室内进行胶片曝光、显影、定影、晾干。βactin作为内参，并用Gelpro32图像分析软件进行分析，蛋白表达量用光密度比值（OD ratio）表示，蛋白表达量用“目的蛋白/βactin”计算。

1.6 数理统计方法

数据采用统计软件SPSS 16.0进行处理，计量资料以平均值±标准差（X±S）表示，采用单因素方差分析（One way ANOVA）对多组样本均数进行比较，M组、EM组、FM组和EFM组4组比较采用双因素方差分析（Univariate），P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。

2 研究结果

2.1 各组肝组织病理形态变化

油红O染色结果（如图1和表1）所示：对照组肝细胞未见明显脂滴；模型组肝细胞胞浆内橘红色脂滴数量增多，大小不一，以小泡性脂肪滴为主；运动组肝细胞胞浆内可见少量橘红色脂滴，脂滴数量在对照组和模型组之间。

2.2 各组大鼠肝脏内质网应激PERK/eIF2a途径蛋白表达变化

各组大鼠肝组织PERK、eIF2a蛋白表达（如图2和表2）结果显示：与对照组比较，模型组和运动PERK、eIF2a蛋白表达升高，其中模型组具有非常显著性差异（P<0.01），运动组PERK蛋白表达具有非常显著性差异（P<0.01），eIF2a蛋白表达差异不具有显著性；与模型组比较，运动组PERK、eIF2a蛋白表达降低，差异具有非常显著性（P<0.01）。

2.3 各组大鼠肝脏内质网应激IRE1/XBP1途径蛋白表达变化

各组大鼠肝组织IRE1、XBP1蛋白表达（如图2和表3）结果显示：与对照组比较，模型组和运动组IRE1、XBP1蛋白表达升高，差异具有非常显著性（P<0.01）；与模型组比较，运动组IRE1、XBP1蛋白表达降低，差异具有非常显著性（P<0.01）。

3 讨论与分析

3.1 动物模型的建立

为深入研究NAFLD的发病机制，建立与人类病变相似的动物模型极为重要。在现有的NAFLD动物模型中，主要有先天性“转基因动物”“化学物质诱导”、病毒诱导及高脂饲料诱导等[9]。高脂饲料诱导的NAFLD动物模型，其病变过程较慢，方法简单、病理特征与人类相似、成功率高而被广泛应用，是国内外学者最常采用的造模方法[10]。

诊断NAFLD的金标准是病理组织学[9]。本实验采用连续8周高脂饮食建立大鼠NAFLD模型，油红O染色可见模型组肝细胞胞浆内脂滴数量增多，大小不一。与对照组比较，模型组油红O脂滴光密度值显著升高（P<0.05），提示本研究NAFLD动物模型复制成功。

3.2 内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途径在NAFLD形成中的变化

PERK是介导ERS反应的重要分子，正常状态下，PERK与GRP78结合成无活性的复合物；ERS时，PERK与GRP78解离，解离出的PERK寡聚化并激活，使eIF2a磷酸化，mRNA和蛋白的转录翻译水平下调，ER蛋白负荷减轻[11]。林志楠等[12]报道，pPERK蛋白在胰岛素抵抗大鼠肝组织中表达升高。本研究结果显示，PERK和eIF2α在生理状态下也少量表达，而在模型组大鼠肝组织中PERK和eIF2α表达明显升高，提示ERS通过介导PERK/eIF2α通路参与高脂饮食诱导NAFLD的形成。

正常状态下，IRE1与GRP78结合成无活性的复合物，ERS时，IRE1与GRP78解离，解离出的IRE1通过非常规剪接XBP1 mRNA激活XBP1。XBP1能促进陪伴蛋白和自身基因的转录，也能促进ERS相关其他靶基因的转录。它是CREB/ATF家族的一个bZIP转录因子。XBP1表达水平的改变会直接影响ERS的反应强度[13]。对于IRE1/XBP1信号通路，国内外的研究大多局限于体外研究。Kirkpatrick等[14]报道，与接受相同处理的XBP1+/+细胞相比，XBP1-/-小鼠的胚胎成纤维细胞在发生ERS后，后者IRS1的酪氨酸磷酸化水平显著降低，IRS1丝氨酸磷酸化显著增强，抑制胰岛素信号转导。而IRE1/XBP1信号通路在大鼠体内的作用未见研究报道。本研究结果显示，高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝组织IRE1、XBP1蛋白表达较对照组明显升高，提示ERS通过介导IRE1/XBP1通路参与高脂饮食诱导NAFLD的形成。

3.3 运动对NAFLD形成的预防作用

现有研究[15]证实，耐力运动可较好地预防脂肪肝。吴明方等[16]报道16周有氧运动可改善NAFLD患者脂质代谢紊乱，降低患者血浆SREBP1 c、TNFa水平。晋娜[17]报道运动可减轻肥胖程度，有效预防脂肪肝。分子水平研究报道，有氧运动对高脂饮食诱导的NAFLD有预防作用可能与其抑制ChREBP基因表达[18]、降低肝脏TNFa mRNA的表达和脂联素mRNA表达有关[19]。有关运动对内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途径的影响尚未见文献报道。本研究结果显示：与模型组比较，运动组肝细胞胞浆内脂滴数量减少，油红O脂滴光密度值显著降低（P<0.05），PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表达降低，提示运动对NAFLD具有较好的预防作用，其机制可能与其减低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表达，减少内质网应激有关。

4 结论

8周高脂饮食可成功复制NAFLD动物模型，内质网应激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途径参与NAFLD形成，运动对NAFLD形成具有较好的预防作用，其机制可能与其降低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表达，减少内质网应激有关。

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