硫酸铜对斑石鲷幼鱼的急性毒性及对眼点淀粉卵涡鞭虫的杀灭效果

范　超，史成银

（1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东青岛　266071；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛　266071；3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海　201306）

硫酸铜对斑石鲷幼鱼的急性毒性及对眼点淀粉卵涡鞭虫的杀灭效果

范超1，2，3，史成银1

（1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东青岛266071；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071；3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

斑石鲷是海水养殖鱼类新品种，对其病害的研究较少。2014年7月和2015年5月国内某斑石鲷育苗场暴发卵鞭虫病，导致幼鱼大量死亡，造成了较大的经济损失。为了安全、有效地防治该病，开展了硫酸铜对斑石鲷幼鱼的急性毒性实验以及对眼点淀粉卵涡鞭虫的杀灭实验。在水温23～25 ℃、盐度30、体积20 L的养殖海水中，采用静水试验法，对平均全长4 cm的健康斑石鲷幼鱼进行硫酸铜急性毒性实验，得出CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼的安全浓度为2.22 mg/L；用浓度为0.10～0.70 mg/L的CuSO4·5H2O无菌海水溶液，在25 ℃恒温条件下处理眼点淀粉卵涡鞭虫涡孢子和包囊体，结果发现0.40 mg/L的CuSO4·5H2O可完全杀灭涡孢子，0.70 mg/L的CuSO4·5H2O可完全抑制包囊体的分裂。因此，在防治斑石鲷幼鱼卵鞭虫病时，CuSO4·5H2O的安全有效使用浓度为0.70～2.22 mg/L。该研究为育苗生产中有效防治斑石鲷卵鞭虫病提供了参考依据。

斑石鲷；眼点淀粉卵涡鞭虫；硫酸铜；急性毒性；安全浓度

斑石鲷（Oplegnathus puncatus）属鲈形目（Perciformes），石鲷科（Oplegnathidae）石鲷属（Oplegnathus），俗称黑金鼓。属于温热带近海鱼类，经济价值高，但自然资源很少。20世纪70年代，日本学者对斑石鲷的育苗技术进行了研究，成功驯化了亲鱼并获得了苗种。但受苗期病害的影响，日本在斑石鲷育苗和养殖方面一直没有形成规模化。2014年，斑石鲷在我国规模化人工繁育成功，成为海水养殖鱼类新品种。斑石鲷生长速度快、抗逆性强、适盐、适温范围广，可食用也可观赏，能在较多区域养殖，有很高的经济价值。由于大规模养殖时间尚短，国内外关于斑石鲷的病害报道也很少。国内仅有几篇虹彩病毒感染斑石鲷的报道［1］。国外（主要是日本）曾报道过斑石鲷上皮囊肿病［2］、病毒性神经坏死病［3-4］和粘孢子虫病［5-6］。到目前为止，国内外还未见有斑石鲷卵鞭虫病的报道。

2014年7月和2015年5月，在国内某斑石鲷育苗场人工育苗过程中分别监测到卵鞭虫病。该病导致了斑石鲷幼鱼大量死亡，造成了较大的经济损失。卵鞭虫病是海水鱼类中常见的寄生虫病，呈世界范围性分布，主要暴发于夏秋高温季节。其病原眼点淀粉卵涡鞭虫（Amyloodinium ocellatum）是一种常见的鱼类体表寄生虫，主要寄生在宿主的鳃和皮肤上［7］。该寄生虫生活史简单，只分为三个阶段：营养体、包囊体、涡孢子。寄生在鱼鳃上的营养体攫取鱼体营养，阻碍鱼的正常呼吸。当包囊体进行二分裂增殖，最后产生大量具有感染性涡孢子。环境条件适宜时，3 d内即可完成一个生活史周期，病原数量的呈几何级增长［4-5］。因此，如没有有效的防治措施，该病会给斑石鲷的人工育苗造成严重影响。

硫酸铜是常用的杀灭寄生虫的渔药，广泛应用于隐鞭虫病、车轮虫病、瓣体虫病、小瓜虫病等疾病的防治［7-8］。硫酸铜对寄生虫的杀灭效果与其浓度呈正相关。然而，过高浓度的硫酸铜会对鱼体健康造成损害，甚至导致鱼的死亡。鱼体对硫酸铜的耐受度与鱼的种类、年龄、水温等因素密切相关，使得硫酸铜的安全使用浓度有较大差异［9-14］。对于斑石鲷幼鱼，目前还没有硫酸铜安全使用浓度的报道。另一方面，过低浓度的硫酸铜无法杀灭寄生虫，对硫酸铜对斑石鲷眼点淀粉卵涡鞭虫有效杀灭浓度尚缺乏研究。本研究开展了硫酸铜对健康斑石鲷幼鱼的急性毒性实验和对眼点淀粉卵涡鞭虫杀灭效果实验，确定了安全、有效的硫酸铜使用浓度，为斑石鲷育苗生产中有效防治卵鞭虫病提供了参考依据。

1　材料与方法

1.1 实验鱼

全长3～4 cm的健康斑石鲷幼鱼取自山东某斑石鲷育苗场。将实验鱼置于20 L的实验池中，驯养3 d后进行实验，实验前1 d停止喂食。实验期间，养殖海水温度23～25 ℃、盐度30、pH 7.5～8.2、溶氧6.8～7.1 mg/L。实验期间持续曝气，不投喂饵料，以排除饵料和排泄物对实验的影响。每24 h更换一次实验海水。

1.2 实验药物

硫酸铜晶体（CuSO4·5H2O）：国药集团化学试剂有限公司产，批号20150210。在实验前，先用双蒸水配制成母液，再根据实验需要稀释成相应的浓度。

1.3 硫酸铜对斑石鲷幼鱼的急性毒性实验

采用静水式试验法［11，15］，先进行预实验，确定适合的给药浓度。设置4个预实验组，分别给予质量浓度为1.56、15.64、78.22、391.08 mg/L的CuSO4·5H2O（相当于1、10、50、250 mg/L的CuSO4），另设1个不加硫酸铜的对照组，每组5尾斑石鲷幼鱼。观察24～96 h，求出100%死亡浓度（绝对致死浓度，即LC100）和无死亡浓度（最大耐受浓度，即LC0）。

正式实验时，依据预实验结果设置5个实验组，即CuSO4·5H2O质量浓度分别为1.56、3.13、4.69、6.26、9.39 mg/L（相当于 1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mg/L的CuSO4），另设1个空白对照组（0.00 mg/L CuSO4）。每组3个平行，共18个实验池，每实验池10尾鱼。先配制好不同浓度的药物，充分混匀后再放鱼至实验池中。在实验开始后的15、30、60 min和2、4、6、8、（14 ± 2）、24、48、72、96 h，详细观察并记录实验鱼的反应情况，发现死鱼及时捞出，填入记录表格，同时剖检记录病变情况。观察并记录的内容包括：鱼的存活状况、行为是否异常、体色变化、体表粘液分泌情况、平衡性。96 h后，停止药浴，更换为普通养殖海水继续饲养未死亡的实验鱼，每天1次观察其存活状态。

根据记录的死亡数据，计算出各组的累积死亡率，用“死亡百分数-几率单位换算表”将累积死亡率转化成几率单位。采用几率单位法，分别计算出CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼24、48、72、96 h的半致死浓度（LC50）。然后用公式SC = 0.3 × 48 h -LC50/（24 h-LC50/ 48 h-LC50）2计算出得出安全浓度［17］。

1.4 硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫的杀灭实验

用海水冲洗发病的濒死幼鱼，收集沉淀于培养皿底部的寄生虫白色包囊体颗粒。然后用无菌海水反复冲洗沉淀，清除从鱼体冲洗下来的杂质。将清洗后的寄生虫包囊体，平均分配到24孔培养板各孔中，共24个孔。设置7个实验组，即CuSO4·5H2O质量浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mg/L，另设1个空白对照组（0 mg/L），每组3个平行。将布好包囊体的培养板置于25 ℃恒温培养，每4 h用显微镜观察并记录各组寄生虫涡孢子的活力和包囊体的分裂情况。

2　结果与分析

2.1 硫酸铜对斑石鲷幼鱼的急性毒性

预实验测得CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼的LC100是15.64 mg/L，LC0是1.56 mg/L。因此，正式实验时，设置5个实验组，即CuSO4·5H2O质量浓度分别为1.56、3.13、4.69、6.26、9.39 mg/L。观察发现：CuSO4·5H2O质量浓度为9.39 mg/L和6.26 mg/L的实验组，池水呈微蓝色。实验开始后30 min内，斑石鲷幼鱼均无明显异常；60 min后，9.39 mg/L和6.26 mg/L实验组中的斑石鲷只在池底处游动，不活跃，反应迟钝，其它实验组活力正常；2 h时，9.39 mg/L和6.26 mg/L组实验池中有少量蓝色絮状沉淀；4 h后，9.39 mg/L和6.26 mg/ L实验组中的斑石鲷活力弱，个别鱼在水中乱游，大部分鱼贴底，活动范围小，其它组无明显变化；6 h后，9.39 mg/L实验组活力很差，有2尾侧偏于池底，呼吸急促，6.26 mg/L实验组无侧偏，鱼群活力差，其它组无明显异常；8 h后，9.39 mg/L实验组共有3尾幼鱼死亡，其它实验组和对照组无死亡，刚死亡鱼体表和鳃丝上附着有蓝色絮状物，鳃丝无血色，解剖观察内脏无明显异常。

96 h内各实验组鱼的累积死亡率见表1。经计算，CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼24、48、72、96 h的LC50分别为9.26、8.59、5.61、4.56 mg/L。由此计算出CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼的安全浓度为2.22 mg/L，相当于硫酸铜对斑石鲷幼鱼的安全浓度为1.42 mg/L。

96 h之后，用养殖海水继续正常饲养各组斑石鲷幼鱼。9.39 mg/L和6.26 mg/L实验组中的鱼相继死亡，4.69 mg/L实验组中的鱼有少数身体偏侧，其余浓度组中的鱼存活良好，摄食正常。

表1　硫酸铜晶体对斑石鲷幼鱼的急性毒性实验结果

2.2 硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫的杀灭效果

实验发现，硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫包囊体的分裂具有抑制作用，且对分裂产生的涡孢子具有杀灭作用。随着硫酸铜浓度的升高，眼点淀粉卵涡鞭虫包囊体进行二分裂所需的时间逐渐延长，直至不能分裂。0.10 mg/L组，实验开始48 h后，包囊体陆续分裂完毕，产生涡孢子，大部分涡孢子有活性，少部分涡孢子沉淀到培养板底部，无活性；72 h后，所有包囊都完成了分裂，进入到涡孢子阶段。0.20 mg/L组，包囊体分裂速度较0.10 mg/L组慢，但72 h后也基本分裂完毕，大部分涡孢子沉淀于底部，少数有活性。0.30 mg/L组，72 h后大部分包囊体分裂完毕，有少数包囊体未能释放出涡孢子，已释放出的涡孢子几乎全部沉淀，无活性。0.40 mg/L组，96 h后有少数包囊体分裂完毕，但涡孢子刚冲出包囊即被硫酸铜杀灭，沉淀聚集于包囊周围。0.50 mg/L组，6 d内很难有涡孢子冲破包囊，分裂出的少数涡孢子也被杀灭于包囊附近。0.60 mg/L组，虽然包囊还能进行分裂，但几乎不能产生涡孢子。0.70 mg/L组，7 d后仍以包囊体的形式沉淀于培养皿底部，无法完成正常的分裂。对照组（0 mg/L组），在48 h内即全部完成分裂，产生大量游动的、活力很强的涡孢子，在显微镜下仅能抓拍到少数涡孢子（图1）。

图1　硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫包囊体分裂的抑制作用及对涡孢子的杀灭效果（80×）

3　讨论

硫酸铜是目前为数不多的可用于杀灭原生动物病原的水产药物，其作用机理是：游离的铜离子可破坏寄生虫体内氧化还原酶的活性，阻碍虫体的物质代谢，使虫体蛋白质变性，从而杀灭寄生虫。然而，硫酸铜对水产动物也具有较强的毒性。已有的研究表明，与镉、锌、铬等重金属相比，铜对水产动物的毒性最高［8、16-20］。此外，有文献报道，硫酸铜对各水产动物的安全浓度差异很大，如鲫鱼幼鱼0.009 mg/L［8，20］、胭脂鱼幼鱼0.57 mg/L［12，17］、斑马鱼1.03 mg/L［10，12］、黄鳝鱼种2.1 mg/L［13，18］、七带石斑鱼初孵仔鱼0.009 mg/L［18］、黑鲷幼鱼0.02 mg/L、真鲷幼鱼0.031 mg/L［11，16］。硫酸铜和硫酸亚铁合剂对水产动物的安全浓度为斜带石斑鱼幼鱼1.485 mg/L［10，15］、星斑川鲽1.09 mg/L［11，15］。因此，鱼体对硫酸铜的耐受性与鱼种类、鱼龄密切相关，也与养殖水温、pH值、水中有机物浓度等相关。在使用硫酸铜治疗水产动物原生动物病时，必须通过实验研究确定硫酸铜对具体鱼种的安全浓度。

本研究确定了CuSO4·5H2O对斑石鲷幼鱼的安全浓度为2.22 mg/L，相当于硫酸铜的安全浓度为1.42 mg/L。与其它鱼类相比，斑石鲷幼鱼对硫酸铜的耐受性较高。然而，本研究用1.56 mg/L的CuSO4·5H2O药浴斑石鲷幼鱼96 h时，3个平行实验池（10尾鱼/池）中，有2个实验池各有1尾幼鱼死亡。经检查发现，这2尾鱼因实验时4 d不投喂饲料，体质变差而死亡。因此，虽然2.22 mg/L的CuSO4·5H2O对大多数斑石鲷幼鱼是安全的，但在实际生产过程中，要尽量保持幼鱼的健康水平，且要慎用高浓度的硫酸铜药浴。该研究结果对斑石鲷育苗过程中安全使用硫酸铜控制原生动物病具有重要意义。

眼点淀粉卵涡鞭虫是鱼类养殖中常见的寄生虫，其宿主范围极广，对环境的耐受性较强，危害很大。生产上常用硫酸铜、福尔马林、双氧水、臭氧等杀灭该寄生虫［3-4］。本研究用不同浓度的CuSO4·5H2O海水溶液处理眼点淀粉卵涡鞭虫的包囊体和涡孢子，发现当CuSO4·5H2O的浓度为0.10 mg/L时，包囊体的分裂和涡孢子的活力基本不受影响。随着CuSO4·5H2O浓度的升高，包囊体进行二分裂所需的时间逐渐延长，涡孢子活力也逐渐下降。当CuSO4·5H2O的浓度为0.40 mg/L时，涡孢子可以全部被杀灭。当CuSO4·5H2O的浓度达到0.70 mg/L时，包囊体不能再分裂，也不会产生涡孢子，可以认为淀粉卵涡鞭虫的分裂增殖被完全抑制。

综合以上研究结果，本研究认为，在防治斑石鲷幼鱼卵鞭虫病时，可根据病情的轻重合理使用CuSO4·5H2O，其安全、有效浓度范围为0.70～2.22 mg/L。生产实践中，应根据发病程度合理确定用药浓度和连续药浴时间，建议0.70 mg/L的CuSO4·5H2O溶液可持续药浴7 d，1.56 mg/L的CuSO4·5H2O溶液持续药浴不超过4 d，大于1.56 mg/L小于2.22 mg/L的CuSO4·5H2O溶液持续药浴3 d，暂停1 d，然后观察幼鱼活力情况，如无异常，继续使用3 d。这样即可完全清除处于不同生活史阶段的淀粉卵涡鞭虫。同时，使用过程中要密切观察斑石鲷幼鱼的反应，及时调整药物使用量。

本研究还发现，硫酸铜可刺激眼点淀粉卵涡鞭虫营养体从鱼体脱落。营养体和包囊体脱落在水中后，趋向于沉到池底。所以，在治疗卵鞭虫病过程中，要每天吸底，以尽可能清除脱落的营养体和包囊体，降低水体中寄生虫的密度。由于涡孢子既可以通过水汽进行传播［3，20］，也可能通过生产工具传播，所以育苗过程中发生卵鞭虫病时，要及时隔离发病育苗池，对生产工具和设备进行杀菌、消毒和灭虫处理，阻断病原传播途径。日常育苗时要以防为主，严控水质和饵料品质，以降低卵鞭虫病的发生率。

硫酸铜是有效治疗卵鞭虫病的药物，但是过量或者长期使用，不仅会对鱼体造成损伤，也会危及水产品质量安全和水环境安全。本研究确定了防治斑石鲷幼鱼卵鞭虫病时硫酸铜的安全、有效使用浓度，为合理用药提供了依据。

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（责任编辑：朱迪国）

Acute Toxicity towards Juvenile Spotted Knifejaw （Oplegnathus puncatus） and Eradication Effect on Amyloodinium ocellatum of Copper Sulfate

Fan Chao1，2，3，Shi Chengyin1
（1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Qingdao，Shandong 266071；2. Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao，Shandong 266071；3. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Spotted knifejaw（Oplegnathus puncatus）is one of the new marine fishes in China，and there are few studies on the diseases of Spotted knifejaw. Outbreaks of Amyloodinium ocellatum were reported in a fish hatchery in July 2014 and May 2015，which resulted in mass mortality of hatchery-reared Spotted knifejaw juveniles and large fi nancial loss. In order to prevent and control Amyloodinium ocellatum safely and effi ciently，acute toxicity test of copper sulfate（CuSO4） towards Juvenile Spotted knifeja w was conducted and the eradication effect of CuSO4on Amyloodinium ocellatum was also identified. In this study，healthy Spotted knifejaw juveniles（about 4 cm in average total length）were used to investigate the acute toxicity of CuSO4. Through hydrostatic test，results showed safe concentration of CuSO4·5H2O towards Spotted knifejaw juveniles was 2.22 mg/L，under conditions of 20 L seawater，water temperature of 23～25 ℃ and salinity of 30. Treated by sterile sea water containing copper sulfate（water temperature of 25℃，CuSO4·5H2O concentration of 0.10～0.70 mg/L），dinospores of Amyloodinium ocellatum could be completely killed by 0.40 mg/L of CuSO4·5H2O and the division of tomonts could be entirely inhibited by 0.70 mg/L of CuSO4·5H2O. Hence，the safe and effective concentration of CuSO4·5H2O used to cure Amyloodiniosis of Spotted knifejaw juveniles was 0.70～2.22 mg/L. This study provided important basis for the treatment of Amyloodiniosis of Spotted knifejaw juveniles.

Spotted knifejaw；Amyloodinium ocellatum；copper sulfate；acute toxicity；safe concentration

S942.2

A

1005-944X（2016）11-0098-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.026

国家科技支撑计划课题（2012BAD17B01）

史成银