不同方法检测奶牛结核病的结果分析

张洪军，王会敏，李秀慧，张秀丽，刘国臣，陈瑞兰，曹　瑞

（1. 河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北围场　068450；2. 青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛　266100）

不同方法检测奶牛结核病的结果分析

张洪军1，王会敏1，李秀慧1，张秀丽1，刘国臣1，陈瑞兰1，曹瑞2

（1. 河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北围场068450；2. 青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛266100）

采用常规皮内变态反应（TST）、牛全血干扰素试验方法（IFN-ɣ）及胶体 金3种检测方法，对2个奶牛场的600头奶牛进行结核病检测，发现结核病阳性率均偏高，表明奶牛场结核病感染较严重。将3种方法检测结果 的敏感性、特异性及符合率进行比较，结果表明：单独使用PPD皮内变态反应方法或胶体金方法在牛结核病的诊断方面存在特异性及符合率差的缺点；用IFN-ɣ实验进行检测，可以提高特异性，避免因假阳性造成的误杀，适合在本地区推广应用。

奶牛结核病；皮内变态反应试验；ɣ-干扰素；胶体金

结核病是一种由结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的人兽共患病，也是一种慢性传染病［1-2］。结核分枝杆菌分为牛型、禽型和人型3种菌型，其中牛型与人型可以互相感染，而禽型也可以感染牛和人［3］。世界动物卫生组织（OIE）已将牛结核病列入须报告动物疫病名录，我国将其列为二类动物疫病。在家畜中，奶牛最易感染结核病。牛结核病的存在严重威胁着人类健康。据报道，人结核病患者中约有30%由牛结核分枝杆菌引起［4］。控制该病的发生直接关系到奶牛养殖业的发展和人民的身体健康，因此检测并且淘汰感染奶牛具有重要意义。

牛全血干扰素实验方法是一种诊断牛结核病的新方法。澳大利亚在消灭牛结核病的行动中就采 用了该方法，最终于1997年消灭了牛结核病［5］。此方法也相继在欧盟及美国等发达国家得到运用。我国目前主要采用皮内变态反应方法（Tuberculin skin test，TST）。TST方法特异性差，仅采用TST方法，极易造成假阳性率高［6-7］。同时，我国对患病牛处理后的经济补偿偏低，这对基层动物疫病预防控制部门的工作带来了巨大压力。以往的实验是通过某一种方法初筛检出阳性个体，再用其他方法对阳性个体进行复检而确诊。本实验的特别之处是运用皮内变态反应、ɣ-干扰素ELISA检测试剂盒及胶体金等3种方法对每一个实验个体进行检测，然后对检测结果进行对比分析。

1　材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的奶牛来自两个规模饲养场。其中1号场远离城镇，环境相对良好且是自繁自育的良种繁育场；2号场是一个养殖小区，在城镇周围，不断有奶牛个体的购入和销售。在各场中随机选取300头不同发育阶段的奶牛，其中100头泌乳牛、100头育成牛、100头犊牛。牛型PPD（批号201502）购自中国兽医药品监察所，100头/瓶；禽型PPD（批号200603）购自中国兽医药品监察所，100头/瓶；牛结核分枝杆菌ɣ-干扰素检测试剂盒（批号P201603-001）购自青岛瑞尔生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应实验（TST）。按照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/ T 18645—2002）的要求操作。结果判定：局部有明显的炎性反应，皮厚差≥4.0 mm为阳性反应；局部炎性反应不明显，4.0 mm＞皮厚差≥2.0 mm为疑似反应；无炎性反应，皮厚差＜2.0 mm为阴性反应。疑似反应牛只于第1次检疫60 d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，60 d后再复检，如仍为疑似反应，则判为阳性。

1.2.2 牛全血干扰素试验方法（牛IFN-ɣ）。采集奶牛的全血，用肝素钠抗凝；在24孔细胞培养板中加入PPD抗原各100 μL，然后将采集的全血分装至24孔细胞培养板（1.5 mL/孔，4孔/份样品），无菌加人PBS（阴性抗原对照）、禽PPD、牛PPD，保证各抗原与分装血液充分混匀；将含有血液和抗原的细胞培养板在37 ℃培养箱中孵育24 h。吸取400 μL上层血浆，转入1.5 mL离心管中，-20 ℃贮存待检。牛结核分枝杆菌ɣ-干扰素检测结果判定：牛型提纯PPD的OD-阴性抗原的OD≥0.1，且牛型提纯PPD的OD-禽型提纯PPD的OD≥0.1判为阳性；牛型提纯PPD的OD-阴性抗原的 OD＜0.1或牛型提纯PPD的OD-禽型提纯PPD的OD＜0.1判为阴性。

1.2.3 结核杆菌检测试剂盒试验（胶体金法）。定性检测结核菌的分泌性蛋白质。当有两条线同时出现时，可判断为阳性；只有一条对照线出现时，则判断为阴性。反应时间15 min，即可判读结果。

2　结果与分析

从表1结果可知，无论采用哪种检测方法，1号场的阳性率都偏高。由此可判定1号场是一个被严重污染的养殖场，场内环境中存在大量的结核分枝杆菌，即使场内个体是自繁自育，也会有不同程度的感染。3种检测方法在奶牛不同生长阶段的检测结果有差异。

胶体金检测结果显示，犊牛、泌乳牛和育成牛的感染率存在较大差异，犊牛阳性率最低，仅为3.33%（10/300）。这可能是犊牛刚刚出生，接触污染源的时间短，加之自身的抵抗力，没有成为感染个体，体内不产生抗体，所以胶体金方法检测不到。

表1　1号奶牛场结核病检测结果

IFN-ɣ检测方法是检测T淋巴细胞分泌的干扰素，可以看到3种牛的检测结果基本一致，由此也可以判断此场是一个被污染的奶牛场， 其中部分奶牛已经染病或者是携病个体，需要对厂区及所有奶牛进行净化处理。

从表2结果可知，2号养殖场的阳性率虽然低于1号场，但整体上还是较高，存在较大的患病风险。此外，2号奶牛场在不断购进各时 期奶牛的同时，也在不断出售奶牛，且还有散养户寄存的犊牛，牛只流动量大，环境相对开放，外界患病或者携带病源的个体极易进入。

从表2中还可以看出，用TST方法检测不同年龄段的奶牛，发现泌乳牛的阳性率为0，育成牛为13.33%，犊牛最大为16.67%。这可能是此养殖场外来寄养的犊牛是携病个体，从而使犊牛阳性检出率偏高。IFN-ɣ检测也能印证这点。据考察，2号奶牛场临近村庄，这也可能是阳性检出率较高的原因之一。和84.33%，高于徐贤坤［9］、朱冬冬等［5］的检测结果。IFN-ɣ试验和胶体金试验比较，除了特异性较高外，敏感性及符合率均比较低；胶体金试验和TST试验比较，胶体金试验存在过多的假阳性。因此，建议在以后的工作当中，更宜将TST试验与IFN-ɣ检测联合用于奶牛结核病的检疫，单一方法检测不可取。

表2　2号奶牛场结核病检测结果

表3　IFN-ɣ、TST方法和胶体金方法检测灵敏性、特异性、符合率的比较

以上2个奶牛场存在TST与IFN-ɣ方法检测阳性、胶体金检测阴性的个体。原因可能是药物注入皮下或者表皮深部组织，PPD抗原成分与其他物质（卡介苗和其他结合分支杆菌）抗原成分相同，易发生交叉反应，出现假阳性；也可能由于记忆性免疫反应出现假阳性或可能是免疫个体受抑制。

出现TST与IFN-ɣ方法检测现阴性、胶体金检测阳性的个体，说明所检测的个体不一定是结核病，可能是感染过结核分枝杆菌，或者注射过相关的药物致使体内产生结核抗体，但并不一定是患病个体。

对2个奶牛场各300份奶牛样本进行了牛结核病IFN-ɣ试验、TST试验和胶体金试验的符合率、敏感性和特异性比较。按照如下公式计算：符合率=（真阳性数+真阴性数）/被检总数；敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）；特异性=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）。

1号奶牛场牛结核病IFN-ɣ试验、TST试验相比的敏感性、特异性和符合率分别为76.93%、80.00%和80.00%；IFN-ɣ试验和胶体金试验比较，其敏感性、特异性和符合率分别为44.00%、80.00%和50.00%；2号奶牛场牛结核病IFN-ɣ试验和TST试验比较，其敏感性、特异性和符合率分别为69.23%、100.00%和86.67%；IFN-ɣ试验和胶体金试验比较，其敏感性、特异性和符合率分别为38.46%、82.35%和63.33%（表3）。

王丽霞等［8］用IFN-ɣ试验和TST试验比较的敏感性、特异性和符合率分别为78.26%、89.09%

［1］ 雷剑明，谢芝勋，谢志勤，等. 牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT_6、MPB70基因的克隆与序列分析［J］. 广西农业科学，2009，40（9）：1229-1233.

［2］ 谢志勤，谢芝勋，刘加波，等. 牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析［J］. 广西农业科学，2010，41（8）：827-830.

［3］ 徐贤坤，熊毅，韦达有，等. ɣ一干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用［J］. 南方农业学报，2013，44（4）：667-670.

［4］ Dye C D，Scheels S M S，Dolin P D，et a1. Global burden of tuberculosis estimated incidence，prevalence，and mortality by country［J］. Joumal of American Medical Association，1999，282（7）：677-686.

［5］ 朱冬冬，孙泉云，曹传闺，等. 牛 ɣ-干扰素 EIA 与TST 检测牛结核病的比较等. 上海畜牧兽医通讯，2010（2）：14-15.

［6］方杰元，黄国敏，韦春葵，等. 广西某奶牛场水牛结核病的检疫报告［J］. 畜牧与兽医，2004，36（1）：35.

［7］谢志勤，谢芝勋，刘加波，等. 变态反应检测水牛结核病标准的探索［J］. 畜牧与兽医，2010，42（12）：60-63.

［8］ 王丽霞，李爱华，王会杰，等. 两种方法检测奶牛结核病的比较分析［J］. 中国动物保健，2015（17）：66-68.

［9］ 徐贤坤，黄小武，蓝纪，等. 两种奶牛结核病检测方法的比较研究［J］. 畜牧与兽医，2010，42（2）：29-33.

（责任编辑：朱迪国）

Results Analysis of Cow Tuberculosis Detection by Different Methods

Zhang Hongjun1，Wang Huimin1，Li Xiuhui1，Zhang Xiuli1，Liu Guochen1，Chen Ruilan1，Cao Rui2
（1. Weichang Animal Disease Prevention and Control Center，Weichang，Hebei 068450；2. Qingdao Riel Biological technology Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266100）

In order to compare the detection results of cow tuberculosis（TB）by different test methods，the tuberculin skin test（TST），the whole blood interferon-gamma（IFN-ɣ）test and colloidal gold detection were applied in detecting TB of 600 cows from two farms. Results showed that t he positive rates of TB by the three methods were all on the high side，which indicated the infection of TB in the cow farms was serious. Comparisons were made in aspects of sensitivity，specifi city and coincidence rates of the testing results by the three methods. The results showed that the sensitivity and specifi city were defi cient when only using PPD intradermal allergy or colloidal gold to detect cow TB，and the specifi city could be improved by the IFN-ɣ test，avoiding manslaughter of cows due to false positive results，hence the IFN-ɣ test was suitable to be applied in this area.

cow tuberculosis；tuberculin skin test；IFN-ɣ；colloidal gold

S855.2

B

1005-944X（2016）11-0086-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.023