传染性皮下及造血器官坏死病毒诱导南美白对虾抗白斑综合征病毒感染的初步研究

张　娜，谢艳辉，袁俊杰，李家侨，斯泽恩

（湛江出入境检验检疫局，广东湛江　524000）

传染性皮下及造血器官坏死病毒诱导南美白对虾抗白斑综合征病毒感染的初步研究

张娜，谢艳辉，袁俊杰，李家侨，斯泽恩

（湛江出入境检验检疫局，广东湛江524000）

为进一步研究对虾抗病毒免疫方法，使用实验室动物病毒感染死亡率分析，研究传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和白斑综合征病毒（WSSV）在感染南美白对虾后的相互作用机制。结果显示，预感染IHHNV后的对虾在进行WSSV攻毒后，对虾的存活率得到了提高。荧光PCR检测病毒量的结果显示，预感染IHHNV再用WSSV攻毒，存活虾体内的IHHNV含量比死亡虾高。研究结果初步证明，IHHNV和WSSV在对虾体内存在相互作用机制，且IHHNV具有抑制WSSV复制的作用。

南美白对虾；传染性皮下及造血器官坏死病毒；白斑综合征病毒；相互作用；机制

南美白对虾是当今世界养殖产量最高的三大虾类之一。近年来，随着养殖品种日益增多和养殖规模的不断扩大，各种对虾疫病日益增多，严重威胁并制约了对虾养殖产业的发展。对虾白斑综合征病毒（WSSV）和对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）是严重危害对虾养殖业的两种病毒。如何对其预防和治疗，目前仍然是对虾养殖业迫切需要解决的课题之一。

许多学者针对WSSV抗病毒基因开展了不少研究，使得越来越多的对虾免疫相关基因被发现［1-2］。如发现对虾在感染WSSV之后，凝集素、铁蛋白、酚氧化酶原、壳多糖酶、Ranbp、Rho、Rab、GTP结合蛋白等表达量都有不同程度的增高。但国内外关于IHHNV和WSSV在感染对虾过程中相互作用机制的研究报道很少。目前虽有关于IHHNV对WSSV感染有抵抗作用的研究［3］，但到目前为止，IHHNV对WSSV的干扰机制还不明确。

本研究使用一系列的实验生物死亡率动力学测定方法，将对虾预感染IHHNV后进行WSSV攻毒，然后测定实验组的存活率和病毒含量，为对虾抗病毒免疫方法的进一步研究提供思路和研究基础。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物。南美白对虾喂养在100 cm长、50 cm高、30 cm宽的水槽中，用不含任何抗病药物的饲料饲养。虾在水槽中饲养7 d以上，备用。随机挑取3条虾，用PCR方法进行病毒排除检测。

1.1.2 病毒液处理。将确认感染WSSV、IHHNV的南美白对虾，去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部组织进行口服传代感染，传代3次；将人工接种WSSV 死亡的对虾，去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部称重，与0. 01 mol/L的PBS（pH7. 4）1:5（g/L）稀释；用玻璃匀浆器匀浆，3 000 r/min 离心20 min；将上清液依次用滤纸和0. 45 μm 滤膜过滤除菌；使用对虾白斑病毒荧光定量PCR检测试剂盒和对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒（上海之江生物公司）分别测定病毒原液中的病毒含量。WSSV病毒悬液约为6.1×1013copies/mL DNA，IHHNV病毒悬液约为4.3×1015copies/mL DNA，- 80 ℃ 冻存备用。

1.1.3 主要仪器设备。冷冻台式离心机（Eppendorf centrifuge 5417R）；紫外可见分光光度计（Bio-Rad）；空气浴摇床（THZ，江苏太仓市实验设备厂）；荧光PCR仪（ABI stepone）。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组。试验分为3组，每组设2个平行小组，每小组20尾虾，随机分组。淘汰体重过低或过高的虾，平均体重约（10±0.5）g。各组分别为非感染非攻毒组（阴性对照组）、非预感染WSSV攻毒组（阳性对照组）、预感染IHHNV后WSSV攻毒组。

1.2.2 病毒灭活试验动物分组。每个试验中，每组设有2个平行小组。IHHNV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后WSSV攻毒组、非预感染灭活的IHHNV后WSSV攻毒组；WSSV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后灭活WSSV攻毒组、非预感染IHHNV后灭活WSSV攻毒组；IHHNV和WSSV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后灭活WSSV攻毒组。

1.2.3 试验组进行IHHNV预感染。将保存的IHHNV病毒悬液稀释100倍，浓度约为1011copies/mL DNA。感染前使虾停食1 d。每小组分2次口服IHHNV悬浮液，每次口服100 μL。然后，饲喂颗粒饲料，每天2次，饲喂3周。3周后，取3条虾进行IHHNV感染检测，进行PCR分析。如果被检测出IHHNV阳性，就立即分为2个平行小组，进行后续攻毒试验。

1.2.4 WSSV口服攻毒。攻毒前，停食1 d。每天2次饲喂WSSV悬液（浓度约为109copies/mL DNA），每次口服100 μL。然后，饲喂颗粒饲料，每天2次。在此期间，收集濒死的虾，用RT-PCR方法分析IHHNV和WSSV感染情况。生物测定持续到攻毒后第10天。对存活的虾，同样检测IHHNV和WSSV感染情况。对预感染IHHNV的虾和未感染IHHNV虾的进行存活率统计分析。

1.2.5 病毒灭活处理。分别取1.2.3和1.2.4中的病毒悬液1 mL，在0.5%的福尔马林中25 ℃孵育10 min，然后用TN 缓冲液洗涤，去除福尔马林。4℃ 20 000 r/min，离心30 min，重复洗涤2次。最后，使病毒颗粒悬浮在TN缓冲液中，保持病毒悬液的体积不变。

1.2.6 病毒灭活试验分组。IHHNV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后WSSV攻毒组、非预感染灭活的IHHNV后WSSV攻毒组；WSSV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后灭活WSSV攻毒组、非预感染IHHNV后灭活WSSV攻毒组；IHHNV和WSSV灭活试验：预感染灭活的IHHNV后灭活WSSV攻毒组。每组预感染和攻毒的时间和方法同1.2.3和1.2.4。

1.2.7 RT-PCR方法检测病毒。使用对虾白斑病毒荧光定量PCR检测试剂盒和对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒测定WSSV、IHHNV的浓度。取濒死的虾、死虾、存活的虾、阴性的活虾、阳性的死虾作为样品，用RT-PCR方法进行IHHNV和WSSV病毒量对比。

2　结果

2.1 IHHNV预感染WSSV攻毒试验组死亡率分析

IHHNV预感染后分设了2个平行小组进行后续攻毒试验。

第一组，在IHHNV预感染3周后，通过PCR可以在虾体内检测到IHHNV感染。进行WSSV攻毒后，每天可观察到死亡情况。阴性对照组无死亡，说明对虾无其他疫病感染。WSSV阳性对照组中，在WSSV攻毒3 d后开始死亡，7 d后所有虾死亡，说明WSSV攻毒成功。在预感染IHHNV试验组中，在WSSV攻毒4 d后开始死亡。在攻毒后5～7 d内死亡率较低，攻毒后第8天死亡数量开始大量增加，攻毒10 d后，死亡对虾11条，存活率为35%（图1）。

图1　IHHNV预感染后WSSV攻毒对虾的存活率（第一组）

第二组，阴性对照组无死亡率，阳性对照组在WSSV攻毒4 d后开始死亡，7 d后所有虾死亡。在预感染IHHNV试验组中，在WSSV攻毒3 d后开始死亡，而在攻毒后4～6 d内死亡率较低，攻毒后第7天死亡数量开始大量增加，攻毒10 d后，死亡对虾12条，存活率为30%（图2）。

2.2 病毒灭活试验组死亡率分析

图2　IHHNV预感染后WSSV攻毒对虾的存活率（第二组）

2.2.1 IHHNV灭活试验组。非预感染灭活IHHNV后攻毒组（阳性对照组）在WSSV攻毒2 d后开始出现死亡，7 d后所有虾死亡，说明攻毒成功。预感染灭活IHHNV后攻毒组的2个平行组，在WSSV攻毒2 d后开始出现死亡，8 d后所有虾死亡，说明灭活IHHNV预感染后不会出现虾的感染，不会产生保护性。

2.2.2 WSSV灭活试验组。预感染灭活IHHNV后灭活WSSV攻毒组：无死亡。非预感染IHHNV后灭活WSSV攻毒组：无死亡。预感染灭活IHHNV后灭活WSSV攻毒组：无死亡。结果说明灭活WSSV不会出现感染虾的情况。

2.3 感染虾的病毒量比对结果

阴性对照组IHHNV和WSSV的RT-PCR检测为阴性。同样，福尔马林灭活的WSSV浸泡感染组IHHNV和WSSV检测均为阴性。预感染IHHNV的活虾、濒死虾、死虾中的IHHNV病毒量RT-PCR检测结果见表1。

从结果看出，两组平行对照组、非感染非攻毒组中（阴性对照组）两种病毒都没有检出。非预感染WSSV攻毒组（阳性对照组）中没有检出IHHNV，WSSV病毒量为1.2×109，说明对照结果成立。

在预感染IHHNV的对虾实验组中，存活的虾体内IHHNV含量明显高于濒死虾和死亡虾，平行对照结果达到7.9×108和8.8×108copies/mL DNA，相反存活的虾体内WSSV含量明显低于濒死虾和死亡虾，平行对照结果为5.2×102和2.2×102copies/mL DNA，实验结果与预期一致。在灭活IHHNV预感染组中，2个平行组没有检出IHHNV，说明灭活的IHHNV没有感染性，同样没有诱导抗感染性。

表1　对虾体内IHHNV和WSSV病毒量RT-PCR检测结果对比

3　讨论

在IHHNV和WSSV干扰机制方面，国外研究鲜有报道，国内未见报道。Melena等［4］将凡纳滨对虾幼体、后期幼体预先感染IHHNV，养殖一段时间后在PL45 期感染WSSV。结果发现，在PL35 期预感染灭活WSSV和在无节幼体5期、幼虫l 期、PL22 期预感染3 次IHHNV 的个体，在感染WSSV 10 d后并未完全死亡，而是分别保持了较低的存活率（4.7%和4%），没有预感染IHHNV 和灭活WSSV 的对照组在感染WSSV 9 d后全部死亡。因此，根据实验结果推测，预先感染IHHNV 的对虾在感染WSSV后抑制了WSSV的复制速度，从而降低了死亡率，这也表明IHHNV可以干扰WSSV在宿主中的复制作用。Tang 等［3］对细角滨对虾预先感染IHHNV后再感染WSSV，检测其病毒拷贝数，也得到类似结果。Molthathong等［5］分别用IHHNV感染性毒株和IHHNV非感染性毒株预感染斑节对虾，用WSSV进行攻毒实验，结果发现用IHHNV感染性毒株预感染的斑节对虾比IHHNV非感染性毒株预感染的斑节对虾存活率高，同时发现IHHNV预感染后的斑节对虾WSSV病毒量少于感染WSSV的对照组。

本研究针对预感染IHNNV的对虾再进行WSSV攻毒感染后的研究结果与国外学者的研究结果一致。同时本研究利用RT-PCR检测灭活IHHNV和灭活WSSV感染后的对虾，结果均为阴性，说明灭活的病毒在对虾体内不能进行复制，同时预感染灭活IHHNV试验组，WSSV攻毒后对虾全部死亡，说明灭活的IHHNV并不具备抑制WSSV感染的保护性。

用RT-PCR定量方法对实验组的死虾、濒死虾和活虾的体内病毒量进行比对，结果证明，在预感染后存活的虾体内IHHNV病毒量最高，而死亡虾的IHHNV病毒量最低，与动物试验结果一致，表明在南美白对虾体内，IHHNV具有抗WSSV感染的作用。

［1］ Tassanakajon A，Klinbunga S，Paunglarp N，et al. Penaeus monodon gene discovery project：The generation of an EST collection and establishment of a database［J］. Gene，2006，384：104-112.

［2］ Gross P S，Bartlett T C，Browdy C L，et al. Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei，and the Atlantic White Shrimp，L.setiferus［J］. Dev Comp Immunol，2001，25：565-577.

［3］ Tang K F J，Durand S V，White B L，et al. Induced resistance to white spot syndrome virus infection in Penaeus stylirostris through pre-infection with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus a preliminary study［J］. Aquaculture，2003（216）：19-29.

［4］ Melena J，Bayot B，Betancourt L，et al. Pre-exposure to infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus or to inactivated white spot syndrome virus（WSSV）confers protection against WSSV in Penaeus vannamei（Boone）postlarvae［J］. Journal of Fish Diseases，2006（29）：589-600.

［5］ Molthathong S，Jitrakorn S，Joyjinda Y，et al. Persistence of penaeus stylirostris densovirus delays mortality caused by white spot syndrome virus infection in black tiger shrimp（Penaeus monodon）［J］. Veterinary Research，2013，9（1）：33.

（责任编辑：朱迪国）

A Preliminary Study on Induced Resistance to White Spot Syndrome Virus Infection in Penaeus vannamei through Pre-infection with Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus

Zhang Na，Xie Yanhui，Yuan Junjie，Li Jiaqiao，Si Ze'en
（Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000）

In order to study the antiviral immune response of Penaeus vannamei，after being infected by infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）and white spot syndrome virus（WSSV），the interaction mechanism was explored by analyzing the morbidity and mortality rates of experimental animals. It was found that when Penaeus vannamei were inoculated with IHHNV in advance，followed by the infection of WSSV，survival rate was increased. Further real-time PCR assay results showed that the viral load of IHHNV was higher in live prawns than in dead ones. Through this study，an interaction between IHHNV and WSSV in the prawns was preliminarily confi rmed during coinfection of the two viruses，and the replication of WSSV could be inhibited by IHHNV.

Penaeus vannamei；IHHNV；WSSV；interaction；mechanism

S945

B

1005-944X（2016）11-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.025

广东出入境检验检疫局科技计划项目（2015GDK 04）