Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法验证

黎 勇，尹海燕（山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治 046000）

Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法验证

黎 勇，尹海燕
（山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治 046000）

试验验证了Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法，为后续试验提供重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的检测方法。以蛋白含量测定国家标准品为标准品，在100～0 μg/mL浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好，相关系数（R2）大于0.99。标准曲线上至少6点（包含两端）满足准确度介于95.2%～111.67%，标准曲线下限准确度介于95.98%～103.6%。高、中、低质量浓度（80，40，20 μg/mL）质控样本批内精密度均介于1.51%～4.41%，批间精密度均介于3.83%～6.36%。综合上述信息，Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法稳定，可重现。重组人血清白蛋白-白细胞介素2在200～10 μg/mL质量浓度范围内均一。

lowry法；蛋白浓度；方法学验证

本试验验证了Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法，为后续试验提供重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的检测方法。现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

标准品，中国食品药品检定研究院购买，批号为270009-201106；供试品，重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白，批号为20140512，规格为0.2 mg/瓶。SIGMA-ALDRICH酚试剂；广东西陇化工厂硫酸铜；国药集团化学试剂有限公司碳酸钠、酒石酸钾；西陇化工股份有限公司氢氧化钠。

1.2 标准样本

取蛋白含量测定国家标准品一支，用水定量稀释至每1 mL含1 mg，作为储备液，即为每1 mL含1 000 μg的标准蛋白质溶液。用纯化水将1 mg/mL的标准品储备液分别稀释至100，80，60，40，20，10 μg/mL作为标准曲线的Cal 1～Cal 6，以纯化水作为Blank（空白对照孔）。

质控样本及最低定量限样本：用纯化水将供试品分别稀释至80，40，20，10 μg/mL作为高、中、低质量浓度质控样本及最低定量限样本。

均一性样本：将供试品用纯化水分别稀释至200，50，10 μg/mL作为高、中、低质量浓度均一性样本。

加标回收率样本：将供试品用纯化水稀释至20，40，60 μg/mL作为未加标样本；将供试品用纯化水稀释至20，40，60 μg/mL，并分别加入20 μg/mL的蛋白含量测定国家标准品作为加标样本。

1.3 试验方法

精密量取一定体积的供试品置试管内，加纯化水至1 mL，加碱式碳酸铜溶液5 mL，摇匀，室温放置10 min，快速加入酚试剂0.5 mL，摇匀，室温放置30 min，显色后，照紫外可见分光光度法，于波长650 nm处测定吸光度。精密量取标准蛋白质溶液0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL分别置于试管中，自“加水至1 mL”起，同法操作。准确量取水1 mL，自“加碱式碳酸铜溶液5 mL”起，同法操作，作为空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。

2 方法验证方法

2.1 标准曲线

在100～0 μg/mL范围内绘制标准曲线，要求相关系数（R2）大于0.99。标准曲线上至少6点（包含两端）满足准确度（实测值/理论值×100%）介于85%～115%，标准曲线下限附近准确度介于80%～120%。

2.2 精密度与准确度［1］

一条标准曲线、3个质量浓度质控样本（每个质量浓度6个样本）为一个分析批，测定3个分析批，每个质量浓度质控样本至少5个满足以下要求。

批内精密度：要求质控样本CV不大于10%，在定量下限附近样本的CV不大于15%。批间精密度：进行3批次试验，要求每批次质控样本CV不大于10%，低浓度质控样本的CV不大于15%。

质控样本的准确度介于85%～115%，低质量浓度质控样本准确度介于80%～120%。

2.3 定量下限［2］

以标准曲线最低质量浓度作为分析方法的定量下限。考察6个样本，要求至少5个样本CV不大于15%，准确度介于80%～120%。

2.4 均一性样本

取高、中、低质量浓度均一性样本测定（高质量浓度均一性样本用纯化水稀释至50 μg/mL后测定，中、低质量浓度均一性样本直接测定），各考察6个样本。测定结果的准确度介于85%～115%（低质量浓度样本准确度介于80%～120%），测定结果的CV在15%以内视为样本均一。

2.5 加标回收率样本

取加标回收率样本测定，未加标样本和加标样本各考察3个样本，样本测定结果的准确度介于85%～115%视为满足要求，加标回收率介于80%～120%视为满足要求［3-4］。

3 试验结果

3.1 标准曲线

在100～0 μg/mL范围内，以质量浓度为纵坐标（Y）、吸光度为横坐标（X）线性拟合绘制标准曲线，相关系数（R2） 大于0.99。标准曲线上至少6点（包含两端）满足准确度介于95.2%～111.67%，标准曲线下限准确度介于95.98%～103.6%。

标准曲线及准确度的测定见表1。

表1 标准曲线及准确度的测定/μg·mL-1

3.2 精密度与准确度

一条标准曲线、3个质量浓度质控样本（每个质量浓度6个样本）为一个分析批，测定3个分析批，每个质量浓度质控样本满足以下要求。

精密度：高、中、低质量浓度（80，40，20μg/mL）质控样本批内精密度均介于1.51%～4.41%，批间精密度均介于3.83%～6.36%。

准确度：各质量浓度质控样本的准确度均介于91.6%～114.38%。

精密度试验结果见表2。

3.3 定量下限

以标准曲线最低质量浓度作为分析方法的定量下限，6个样本CV为5.49%，准确度介于95.98%～108.3%。

定量下限试验结果见表3。

3.4 均一性样本

重组人血清白蛋白-白细胞介素2各浓度均一性样本的准确度介于86.28%～113.97%，CV介于2.27%～10.16%。

均一性样本试验结果见表4。

3.5 加标回收率样本

未加标样本的准确度介于89.23%～102.05%，加标回收率介于84.73%～107.21%。

回收率试验结果见表5。

表2 精密度试验结果

表3 定量下限试验结果

表4 均一性样本试验结果

3.6 影响研究可靠性和造成研究工作偏离试验方案的异常情况

标准品保存条件为-20℃或以下温度，实际保存温度为-14.8～-33.9℃，超出规定温度最长持续时间小于1.5 h。鉴于温度偏差不大，持续时间不长，且后续检测中标准曲线稳定，故认为该偏离对试验结果无影响。

未见其他影响研究可靠性和造成研究工作偏离试验方案的异常情况。

4 结论

Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法稳定，可重现。重组人血清白蛋白-白细胞介素2在200～10 μg/mL质量浓度范围内均一。

The study on Methodology Validation of Recombinant Human Serum Albumin Interleukin 2 Fusion Protein by Lowry Method

LI Yong，YIN Haiyan
（Shanxi Kangbao Biological Products Co.，Ltd.，Changzhi，Shanxi 046000，China）

This test verifies the Lowry method which determines the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2，and provides a method that can determine the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2 for the following experiment.Methods:In the experiment of determination of protein content，national standard protein was measured as the standard，in the concentration range of 100～0 μg/mL we create a standard curve with good linear correlation and the coefficient（R2） is greater than 0.99.Results:The standard curve contains six points（both ends inclusive） at least and it can satisfy the accuracy ranged from 95.2%～111.67%，and the accuracy of the lower limit of the standard curve is between 95.98%～103.6%.The precisions of protein concentration（high，middle，low）of samples were between 1.51%～4.41%.The precisions between three batches were 3.83%～6.36%.The Lowry method for protein concentration of human serum albumin-interleukin 2 fusion is stable and repeatable.The data of protein concentration between 200～10 μg/mL were stable.

lowry method；protein concentration；method validation

R927.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.013

1671-9646（2016）10a-0042-03

2016-07-15

黎 勇（1982— ），男，本科，助理工程师，研究方向为生物制药的发酵、纯化、检验及检验的方法学验证。