复合酶法制备汉麻籽多肽的工艺研究

宋淑敏，魏连会，董 燕，刘宇峰（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

复合酶法制备汉麻籽多肽的工艺研究

宋淑敏，魏连会，董 燕，刘宇峰
（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复合酶解汉麻蛋白制备汉麻籽多肽，在单因素试验基础上采用正交试验设计，以汉麻蛋白的水解度为考核指标，探讨各酶解因素对水解度的影响，优化复合酶水解蛋白的最佳工艺条件。试验结果表明，复合酶最佳酶解条件为酶解温度70℃，木瓜蛋白酶加酶量0.4%（底物质量），中性蛋白酶加酶量3.0%（底物质量），pH值5.0，料液比1∶5，酶解时间3 h。在该工艺条件下水解度为27.23%，与单一酶法相比，水解度明显提高。关键词：汉麻；复合酶；多肽

汉麻（Cannabis sativa L.）又称大麻、火麻，是大麻科大麻属一年生草本植物［1］。汉麻整个植株均可以开发利用，广泛应用于新材料、纺织、军需装备、制药、食品等领域［2］。目前，许多国家都在大力开发和利用汉麻，尤其是以汉麻籽食品的开发备受人们关注。

汉麻籽主要是以加工油脂为主，油脂加工后的汉麻籽粕主要作为饲料处理，大大降低了汉麻籽利用率和附加值。汉麻籽具有较高的营养价值，汉麻全籽的蛋白质含量一般为20%～25%，汉麻蛋白质中含有21种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸［3］。大量研究结果表明，蛋白质由于其分子量大、结构复杂，摄入人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥［4］。多肽具有原蛋白质所不具备的良好溶解性、高稳定性、高保湿性、抗凝胶性等［5］，还具有易吸收、降血糖、抗氧化［6］、免疫调节等多种生理功能，因此多肽具有良好的开发前景［4］。

本研究采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复合酶解制备汉麻籽多肽，通过优化复合酶酶解的工艺条件，以期提高汉麻蛋白水解度及多肽得率，为汉麻籽多肽在食品和药品领域的开发利用奠定基础，对进一步提高汉麻籽深加工的附加值、促进汉麻产业发展具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

脱脂汉麻籽粕粉，由黑龙江省科学院大庆分院自制。脱壳汉麻籽经超临界CO2萃取油脂，再将脱脂的汉麻籽粕粉碎过60目筛备用。

木瓜蛋白酶（酶活力为8×105U/g）、中性蛋白酶（酶活力为1.3×105U/g），购自无锡雪梅酶制剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基本成分的测定［6］

蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，脂肪含量的测定采用索氏抽提法，水分的测定采用常压烘干法，灰分的测定采用高温灼烧法。

1.2.2 水解度的测定［7］

采用福林酚比色法，按公式计算：

式中：N0——不同质量浓度汉麻蛋白溶液氮含量，mg/mL；

N1——蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/mL；

N2——蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/mL。

1.2.3 工艺流程

汉麻籽粕粉→加水调整料液比→调节pH值和温度→加蛋白酶→恒温水浴摇床酶解→灭酶→酸沉→离心→取上清液→真空低温冷冻干燥→多肽粉。

1.2.4 单一酶最佳酶解条件的优化

中性蛋白酶各影响因素的单因素试验，在单因素试验的基础上以水解度为指标，选择酶解温度、pH值、加酶量、料液比4个影响因素，采用L9（34）正交表进行正交试验，对中性蛋白酶、木瓜蛋白酶最佳酶解条件进行优化。

1.2.5 复合酶酶解条件的优化

在中性蛋白酶、木瓜蛋白酶最佳酶解条件基础上，以水解度为评价指标，选择酶解温度、pH值、加酶量为试验因素，采用L9（34）正交表进行正交试验，对中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配的最佳酶解条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 中性蛋白酶的单因素试验结果

主要研究酶解温度、酶解时间、加酶量、pH值、料液比5个影响因素对中性蛋白酶酶解汉麻籽蛋白的影响。

酶解温度对中性蛋白酶水解作用的影响见图1。

图1 酶解温度对中性蛋白酶水解作用的影响

由图1可知，中性蛋白酶在pH值7.0，料液比1∶10，加酶量2.0%，酶解时间3 h时，酶解温度30～40℃，随着酶解温度的升高水解度（DH）也逐渐增大；酶解温度超过40℃后，随着酶解温度的升高水解度降低，因此中性蛋白酶最佳酶解温度为40℃。

酶解时间对中性蛋白酶水解作用的影响见图2。

图2 酶解时间对中性蛋白酶水解作用的影响

由图2可知，在pH值7.0，料液比1∶10，加酶量2.0%，酶解温度40℃时，酶解时间1～3 h，水解度上升的幅度最大；超过3 h，水解度下降，但下降的幅度减缓。因此最佳的酶解时间为3 h，此时水解度达到最大值。

加酶量对中性蛋白酶水解作用的影响见图3。

图3 加酶量对中性蛋白酶水解作用的影响

由图3可知，pH值7.0，料液比1∶10，酶解温度40℃，酶解时间3 h，水解度随着加酶量的增加而上升；当加酶量超过2.5%时，水解度略有降低。因此，加酶量以2.5%为最佳。

料液比对中性蛋白酶水解作用的影响见图4。

图4 料液比对中性蛋白酶水解作用的影响

由图4可知，在pH值7.0，加酶量2.5%，酶解温度40℃，酶解时间3 h时，料液比以1∶10为分界点，在1∶5～1∶10，随着料液比的降低，水解度逐渐增大；在1∶10～1∶25，随着料液比的降低，水解度逐渐降低。因此，最佳料液比为1∶10。

pH值对中性蛋白酶水解作用的影响见图5。

图5 pH值对中性蛋白酶水解作用的影响

由图5可知，在料液比1∶10，加酶量2.5%，酶解温度40℃，酶解时间3 h时，pH值在6.0～6.5，水解度上升的幅度非常大；pH值在6.5～8.0，随着pH值的增加，水解度逐渐降低。因此，最佳pH值为6.5。

综合以上单因素试验结果，中性蛋白酶的最适水解条件为酶解温度40℃，酶解时间3 h，pH值6.5，料液比1∶10，加酶量2.5%。

2.2 中性蛋白酶正交试验结果

根据单因素试验结果，对中性蛋白酶酶解汉麻蛋白的各影响因子进行正交试验，确定中性蛋白酶酶解的最佳条件，酶解时间为3 h。

中性蛋白酶正交试验结果见表1。

表1 中性蛋白酶正交试验结果

通过极差分析，影响中性蛋白酶水解度各因素的主次关系为A＞D＞C＞B，即酶解温度对水解度的影响最大，是关键的影响因素，其次是料液比。得出最佳工艺条件为A3B1C3D1，即酶解温度45℃，pH值6.0，加酶量3.0%，料液比1∶5。在该工艺条件下水解3 h，水解度为18.24%。

2.3 木瓜蛋白酶的正交试验

通过木瓜蛋白酶单因素试验（略）筛选出木瓜蛋白酶最佳的酶解条件为酶解温度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶10，酶解时间1 h。为了确定在多因素条件下木瓜蛋白酶的最佳条件以及各因素对水解度影响的差异大小，以DH为评定指标，对木瓜蛋白酶的酶解温度、pH值、加酶量、料液比4个主要因素采用L9（34）正交表进行正交试验，酶解时间为1 h。

木瓜蛋白酶正交试验结果见表2。

表2 木瓜蛋白酶正交试验结果

由表2可知，最优水平组合为A'2B'2C'2D'1，即酶解温度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶5时，酶解效果最好。通过极差分析，各因素影响的主次顺序为B'＞D'＞C'＞A'。通过对最优组合A'2B'2C'2D'1验证试验，在酶解温度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶5条件下酶解1 h，木瓜蛋白酶酶解汉麻蛋白的水解度为21.16%。

2.4 木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复配酶解条件的优化根据木瓜蛋白酶、中性蛋白酶最佳酶解条件，对

2种酶复配的pH值、酶解温度、加酶量采用L9（34）正交表进行正交试验，料液比1∶5，酶解时间3 h。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复配正交试验结果见表3。

表3 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复配正交试验结果

由表3可知，影响汉麻蛋白水解度因素的主次关系为B''＞A''＞C''＞D''，酶解温度对复合酶水解的影响最大，其次是pH值。最佳条件组合为A''1B''3C''2D''3，即酶解温度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶加酶量0.4%，中性蛋白酶加酶量3.0%。经试验验证该工艺条件下的水解度为27.23%。

3 讨论与结论

（1）通过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复配水解汉麻蛋白，经正交试验优化后的酶解最佳条件为酶解温度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶加酶量0.4%，中性蛋白酶加酶量3.0%；最佳酶解条件下复合酶水解汉麻蛋白水解度为27.23%。

（2）研究表明，在单酶水解过程中木瓜蛋白酶水解效果要强于中性蛋白酶，但2种酶复合后有增效作用。采用复合酶法制备汉麻籽多肽的工艺，其水解度比利用单酶酶解的水解度有明显提高。此外，采用双酶同步水解，可以简化酶解的操作程序，更易于工厂化生产。

［1］ 关凤芝.大麻遗传育种与栽培技术 ［M］.哈尔滨：黑龙江人民出版社，2010：57-69.

［2］ 许树文，刘华．工业大麻的开发利用及其市场前景 ［J］.纺织导报，2005，27（7）：62-64．

［3］ 何锦凤，张琨，陈天鹏.汉麻籽的营养成分和功能 ［J］.食品科技，2007（6）：258-259.

［4］ 孔令明，李芳，陶永霞，等.多肽的功能活性与研究进展 ［J］.中国食品添加剂，2009（3）：71-72.

［5］ 孙显慧，蒋文强.大豆多肽的功能特性及其开发应用［J］.粮食与油脂，2004（5）：7-10.

［6］ 侯曼玲．食品分析 ［M］．北京：化学工业出版社，2004：273-285．

［7］ 赵新淮，冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究［J］.东北农业大学学报，1995（2）：178-181.◇

Double Enzyme Hydrolysis for Preparation of Cannabis Sativa L.Peptidesis

SONG Shumin，WEI Lianhui，DONG Yan，LIU Yufeng
（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to prepare peptides，papain and neutral protease is chosen to hydrolyze the protein of Cannabis sativa L. Firstly we use method of single-factor as basement to research and then comprehensively use the orthogonal experimental to find the most optimal starch hydrolysis process.By analyzing the degree of Cannabis sativa L，the best conditions of their enzymolysis are probed into.The result show that the most optimum hydrolysis technique is as follow：enzyme temperature is 70℃，pH value is 5.0，the amout of papain is 0.4%，the amount of neutral is 3.0%，the solid-liquid rate is 1∶5，enzymatic hydrolysis time is 3 horus.After improving the technological conditions，the final degree of complex hydrolysis are 27.23%.It is increased significantly compare with single enzymatic hydrolysis.

Cannabis sativa L.；complex enzyme；polypeptide

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.007

1671-9646（2016）10a-0022-03

2016-08-01

黑龙江省财政厅、黑龙江省科学院资助项目（20160101）。

宋淑敏（1968— ），女，本科，研究员级高级农艺师，研究方向为植物生物技术。