大孔树脂分离纯化豆酱中大豆苷元的研究

关 琛，李志江，魏春红，臧延青，王鹤霖，丁 洁（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

大孔树脂分离纯化豆酱中大豆苷元的研究

关 琛，*李志江，魏春红，臧延青，王鹤霖，丁 洁
（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

以豆酱中游离异黄酮大豆苷元为研究对象，经比较选择AB-8型大孔树脂进行大豆苷元的分离纯化。结果显示，最佳动态吸附解析条件为上样质量浓度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脱速度2.0 mL/min。在此条件下，大豆苷元的纯度为71.50%。

大豆苷元；大孔树脂；纯化

0 引言

豆酱是我国传统的发酵食品，以大豆作为主要原料［1］，味道醇厚、咸鲜适口，营养成分主要有大豆异黄酮、多肽、功能性低聚糖、蛋白黑素类、大豆皂苷等［2］。大豆异黄酮在预防骨质疏松、抗肿瘤、预防和缓解妇女更年期综合症等多方面都有较好的功效。

对大豆异黄酮的提取研究大多以总异黄酮为研究对象，而大豆苷元单体成分则具有更高的生物活性。通常可采用溶剂萃取法、微波辅助萃取法、薄层层析和纸层析等进行分离提取；随着分离技术的发展，运用高速逆流色谱法、超临界CO2抗溶剂法、膜分离等新技术也取得了较好的效果［3-5］。

大孔吸附树脂是一种弱极性聚合物吸附剂，其聚合单体为苯乙烯和丙酸酯，交联剂为乙烯苯，致孔剂为甲苯、二甲苯［6］。因其操作简便、成本低、易再生、除去干扰成分效果好［7-8］而被广泛使用。

本文在前期试验基础上，以成品豆酱为原料，通过大孔树脂分离纯化大豆苷元，以探究豆酱功能性成分的组成及含量，为豆酱的综合利用、研制富含大豆苷元的食品、开发保健品等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成品豆酱，黑龙江农垦宝泉酱业提供；大豆苷元，购自Sigma公司，纯度≥99%；AB-8，HPD-600，ADS-7和D101型大孔树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司提供；乙腈、二甲基亚砜、甲醇、乙醇，均为分析纯；水为纯净水。

1.2 仪器与设备

Z型玻璃层析柱（40 cm×2.0 cm），上海精科实业有限公司产品；Agilent 1200型高效液相色谱仪，杭州天钊科技有限公司产品；HD-9797型电脑紫外检测仪、HL-2D型定时数显恒流泵，上海精科实业有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 大孔树脂的静态吸附试验

（1）静态吸附率、解析率的测定。称取预处理过的5 g湿树脂、100 mL大豆苷元提取液置于锥形瓶中，25℃吸附24 h后，吸取上清液，测定大豆苷元酮的质量浓度。计算大孔吸附树脂对大豆苷元的吸附量Q和吸附率E。

式中：C0——吸附前大豆苷元质量浓度，mg/mL；

C1——吸附后大豆苷元质量浓度，mg/mL；

V——溶液体积，mL；

W——大孔树脂湿质量，g。

滤去上清液后，用蒸馏水洗涤，待洗涤液呈无色透明时，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），25℃下解析24 h后，吸取上清液，进行大豆苷元质量浓度的测定。

（2）静态吸附、解析动力学曲线的测定。称量5 g预处理的湿树脂、100 mL的大豆苷元提取液置于锥形瓶中，于25℃吸附，每30 min取样，测定大豆苷元的质量浓度。

吸附后的树脂滤出水洗后，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），25℃摇床进行振荡，间隔20 min取样，测定大豆苷元的质量浓度。

（3）静态吸附、解析条件的选择。①吸附时间对静态吸附效果的影响，称取5 g预处理的湿树脂、100 mL大豆苷元提取液置于锥形瓶中，25℃吸附12 h，每隔2 h吸取上清液，计算吸附率以确定最佳吸附时间。②洗脱时间对静态吸附效果的影响，吸附后的树脂滤出，水洗后置于锥形瓶中，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），洗脱12 h，每隔2 h吸取上清液，计算吸附率以确定最佳洗脱时间。③乙醇体积分数对静态吸附效果的影响，将吸附后的树脂滤出，水洗后置于锥形瓶中，分别加入100 mL体积分数为30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液（V/V），洗脱12 h后，吸取上清液，计算吸附率以确定最佳的乙醇体积分数。

1.3.2 大孔树脂吸附的动态试验

（1）吸附速度对动态吸附试验结果的影响。树脂预处理后装入玻璃层析柱进行淋洗，上样质量浓度为2 mg/mL，将提取液以1.0，2.0，3.0 mL/min的速度泵入。上样后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脱速度为2.0 mL/min，根据图谱选择最佳吸附速度。

（2）洗脱速度对吸附动态试验结果的影响。树脂预处理后装入玻璃层析柱进行淋洗，上样质量浓度为2 mg/mL，以2.0 mL/min的速度泵入层析柱。上样后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脱速度分别为1.0，2.0，3.0 mL/min，根据图谱选择最佳洗脱速度。

（3） 上样质量浓度对吸附动态试验结果的影响。将预处理后的树脂装入玻璃层析柱后进行淋洗，制备大豆苷元质量浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的提取液，吸附速度为2.0 mL/min。上样后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脱速度为2.0 mL/min，根据图谱选择最佳上样质量浓度。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂吸附的静态吸附试验结果

2.1.1 树脂的选择

不同树脂对大豆苷元的静态吸附、解析效果见表1。

表1 不同树脂对大豆苷元的静态吸附、解析效果

AB-8和ADS-7型大孔树脂对大豆苷元的吸附率较好；HPD-600和AB-8型大孔树脂对大豆苷元的解析率较好；D101型大孔树脂的吸附率和解析率都比较差。综合静态吸附、解析效果，试验选择AB-8，HPD-600和ADS-7型大孔树脂分别进行静态吸附解析试验，以确定纯化大豆苷元最佳的树脂材料。

2.1.2 3种大孔树脂静态吸附、解析条件的确定

（1）吸附时间对吸附效果的影响。吸附时间对吸附效果的影响见图1。

图1 吸附时间对吸附效果的影响

由图1可知，AB-8，HPD-600型大孔树脂对大豆苷元的吸附率达到最高需4 h，ADS-7型大孔树脂需要8 h。AB-8和ADS-7型大孔树脂对大豆苷元的吸附效果比HPD-600型大孔树脂好。

（2）解析时间对解析效果的影响。

解析时间对解析效果的影响见图2。

图2 解析时间对解析效果的影响

由图2可知，AB-8，HPD-600，ADS-7型解析率分别在2，3，5 h达到最高，AB-8和HPD-600型大孔树脂解析率比ADS-7型大孔树脂高。

（3）洗脱剂乙醇体积分数对吸附效果的影响。

乙醇体积分数对解析效果的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对解析效果的影响

由图3可知，当乙醇体积分数为40%时，可以将AB-8型大孔树脂上吸附的大豆苷元解析完全，而ADS-7和HPD-600型大孔树脂需要60%的乙醇。

综上，AB-8型大孔树脂的吸附量大、吸附快、解析率高，适合用于大豆苷元的分离纯化。

2.2 AB-8型大孔树脂的动态吸附试验

2.2.1 吸附速度对动态吸附效果的影响

不同吸附速度的洗脱图谱见图4。

图4 不同吸附速度的洗脱图谱

由图4可知，吸附速度为1.0，2.0，3.0 mL/min，对动态吸附效果影响不大。故在实际操作中，可以选择与洗脱速度相同的吸附速度，不必再调节恒流泵。

2.2.2 洗脱速度对动态解析效果的影响

不同洗脱速度的洗脱图谱见图5。

图5 不同洗脱速度的洗脱图谱

由图5可知，洗脱速度为2.0 mL/min时洗脱效果最好，有4个洗脱峰，40%与80%乙醇2个峰有较好的分离度；洗脱速度为1.0 mL/min时，洗脱峰均有拖尾，洗脱周期长且第2、第3洗脱峰重叠；洗脱速度为3.0 mL/min时，40%，80%乙醇洗脱2个峰的分离度均大幅下降。故选择洗脱速度为2.0 mL/min。

2.2.3 上样质量浓度对动态吸附效果的影响

不同上样质量浓度的洗脱图谱见图6。

由图6可知，当上样质量浓度为1，2，3 mg/mL时均有4个洗脱峰；当上样质量浓度为1，2 mg/mL时洗脱峰的分离度比较好，但峰型不好，收集范围不容易确定；当上样质量浓度大于3 mg/mL时，洗脱峰重叠较多，分离效果较差。故选择上样质量浓度为3 mg/mL。

图6 不同上样质量浓度的洗脱图谱

2.2.4 最佳动态吸附解析条件下的洗脱图谱

最佳工艺的洗脱图谱见图7。

图7 最佳工艺的洗脱图谱

确定动态吸附解析条件为上样质量浓度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脱速度2.0 mL/min。

2.3 纯化后大豆苷元的纯度

收集最佳工艺的洗脱液后进行浓缩，测定浓缩液的体积，通过高效液相色谱测定大豆苷元含量，冷冻干燥后称量。

式中：C——大豆苷元含量，mg/L；

V——浓缩液体积，L；

m——冷冻干燥后质量，mg。

大豆苷元经AB-8型大孔树脂纯化后纯度为71.50%。

3 结论

通过比较AB-8，D101，ADS-7，HPD-600型大孔树脂对大豆苷元的静态吸附效果，选择了吸附量较大、吸附速度较快、解析率较高的AB-8型大孔树脂对大豆苷元进行分离纯化。确定最佳动态吸附解析条件为上样质量浓度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脱速度2.0 mL/min，大豆苷元的纯度为71.50%。

［1］ 包启安.酱及酱油的起源及其生产技术（一） ［J］.中国调味品，1992（9）：3-6，25.

［2］ 范俊峰，李里特，张艳艳，等.传统大豆发酵食品的生理功能 ［J］.食品科学，2005，26（1）：250-254.

［3］ 彭义交，刘宗林.大豆异黄酮双向纸层析分析方法的研究 ［J］.食品科学，2004，25（4）：141-144.

［4］ 杨学东，邓志成，王晶，等．反相高效液相色谱法制备纯化大豆异黄酮糖苷 ［J］.色谱，2006，24（4）：363-366.

［5］ 曲丽萍，宓鹤鸣，范国荣，等.高速逆流色谱法分离制备淡豆豉中大豆素和染料木黄酮 ［J］.中草药，2006，37（3）：375-377.

［6］ 李乃洁，周长民，刘然.合成着色剂标准样品杂质纯化的基本方法 ［J］.品牌与标准化，2011（24）：35-37.

［7］ 王如意，安日明.HP20大孔吸附树脂对L-苯丙氨酸吸附条件的研究 ［J］.广东化工，2011（6）：78-80.

［8］ 陈琛.白藜芦醇提纯技术研究进展 ［J］.精细与专用化学品，2011（3）：39-42.◇

Study on Purification of Daidzein from Soy Sauce by Macroporous Resin

GUAN Chen，*LI Zhijiang，WEI Chunhong，ZANG Yanqing，WANG Helin，DING Jie
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to free soy is oflavones daidzein as research object，using AB-8 resin to isolate and purify daidzein which extracted from soy sauce.The results show that AB-8 resin has a good isolation and purifying ability for daidzein.The optimum conditions are as follows：the concentration of loading sample is 3 mg/mL，the adsorption flow rate is 2.0 mL/min，the desorption flow rate is 2.0 mL/min.Under these conditions，the purity of daidzein is 71.50%.

daidzein；macroporousresin；purification

S816.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.004

1671-9646（2016）10a-0013-04

2016-08-22

大庆市指导性科技计划项目（SZDFY201533）。

关 琛（1983— ），女，硕士，讲师，研究方向为发酵与酿造技术。

*通讯作者：李志江（1977— ），男，博士，副教授，研究方向为发酵与酿造。