宁夏地区奶牛子宫内膜炎的病原体分离鉴定及药敏试验

康晓冬刘溪源高海慧

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏银川市畜牧技术推广服务中心，宁夏银川 750001）

宁夏地区奶牛子宫内膜炎的病原体分离鉴定及药敏试验

康晓冬1刘溪源2高海慧1

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏银川市畜牧技术推广服务中心，宁夏银川 750001）

为了弄清楚宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌的种类、分布情况及药物敏感性，为防治提供理论依据，对在宁夏地区部分奶牛场采集的180份子宫内膜炎分泌物进行病原菌分离鉴定，并对主要病原菌进行药敏试验。检出细菌265株，酵母样真菌5株，其中葡萄球菌33株（12.22%），链球菌3株（1.11%），其他革兰氏阳性球菌32株（11.85%），革兰氏阴性杆菌190株（70.37%），芽孢杆菌6株（2.22%），阳性杆菌1株，没有分离出专性厌氧菌。22种药物的药敏试验结果表明:病原菌对磺胺类、林可酰胺类药物均已产生不同程度的耐药性，而氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢类药物则表现出较好的抑菌效果。

子宫内膜炎病原菌分离鉴定药敏试验

子宫内膜炎（Endometritis）是指炎症仅局限于子宫内膜的病理过程。本病是奶牛的常见病和多发病。该病发生后，由于子宫黏膜的炎症变化、炎性产物及细菌毒素的影响，使奶牛的性周期紊乱，危害精子的活性及胚胎的着床，致使屡配不孕，成为引起奶牛不孕症的主要原因之一，如果治疗不及时或治疗不当，往往影响奶牛的繁殖力和产奶量，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。奶牛子宫内膜炎的发病率很高，据报道，我国奶牛子宫内膜炎的发病率约为20%-50%，奶牛不孕症的60%-80%是由奶牛子宫内膜炎引起。目前，国内外针对其感染的主要治疗药物还是以抗微生物类药物为主。大量的研究表明，奶牛因为所处地域的自然环境不同、饲养管理方式的差异、临床用药习惯方式的不同等各种因素，奶牛子宫内膜炎的主要致病菌种类存在差异，致病菌的药物敏感性也存在很大的差异，在药物选择压力作用下，病原菌中的耐药菌株不断增多，不仅严重影响了奶牛子宫内膜炎的防治，而且奶牛源性病原菌对抗微生物药物耐药性的形成也给人类健康带来了严重的潜在威胁。

因此，针对奶牛子宫内膜炎主要病原菌进行分离鉴定，明确主要致病菌的种类及分布流行情况，对病原菌进行危害性分析和评估，在此基础上针对主要致病菌进行体外抗微生物药物敏感试验，对于提高奶牛子宫内膜炎的治愈率，指导临床用药具有积极的意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1培养基、微生物鉴定卡等

营养琼脂（批号130716），北京路桥技术有限责任公司生产；麦康凯琼脂（MAC，批号：20130624）、伊红美兰琼脂（EMB，批号20120928）、甘露醇高盐琼脂（MSA，批号20131114）、TTC-沙堡罗培养基（批号20121017）、硫乙醇酸盐液体培养基（批号20132529）、固体厌氧培养基（批号20131223）、2.5L厌氧培养带（含厌氧产气包、氧气指示剂），青岛高科园海博生物技术有限公司生产；脱纤维绵羊鲜血琼脂培养基按常规方法配制。

革兰氏阴性细菌鉴定卡、革兰氏阳性细菌鉴定卡、酵母菌鉴定卡由美国 BioMerieux，Inc生产。

1.1.2抗生素药敏纸片

四环素（30ug/片，批号20150521）、庆大霉素（10ug/片，批号20150429）、链霉素（10ug/片，批号20150513）、卡那霉素（30ug/片，批号201505/9）、丁胺卡那霉素（30ug/片，批号20150524）、阿莫西林（10ug/片，批号20150511）、林可霉素（2ug/片，批号20150727）、环丙诺氟沙星（5ug/片，批号20150727）、氧氟沙星（5ug/片，批号20150514）、诺氟沙星（10ug/片，批号20150813）、先锋霉素Ⅳ（30ug/片，批号20150525）、先锋霉素Ⅴ（30ug/片，批号20150816）、先锋霉素Ⅵ（30ug/片，批号20150423）、头孢曲松（30ug/片，批号20150720）、哌拉西林（100ug/片，批号150508）、红霉素（15ug/片，批号150521）、氨苄西林（10ug/片，150407）、恩诺沙星（5ug/片，批号150519）、氟苯尼考（30ug/片，批号150609）、头孢噻肟（30ug/片，批号150416）、复方新诺明（23.75ug/片，批号150520）、万古霉素（30ug/片，批号150514）等22种药敏试纸片，杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.1.3主要仪器

超净工作台（SW-CJ-1FD，苏净集团安泰公司）

全自动微生物鉴定系统（VITEK-2-Compact15，法国梅里埃公司）电热恒温培养箱（PHP-9162，浙江托普仪器有限公司）电子比浊仪（DensiCHEK Plus，美国 BioMerieux，Inc）

1.2方法

1.2.1子宫内膜炎子宫分泌物采集

选择临床检查判定为子宫内膜炎奶牛，先掏空奶牛直肠宿粪，并用1%的高锰酸钾溶液清洗外阴周围；然后用75%的酒精棉球对阴道边缘及内侧进行消毒；采用直把输精的方法子宫内插入改造并灭菌的输精枪外套，抽去输精枪，用一次性灭菌注射器输入50ml灭菌生理盐水，轻轻按摩子宫，回吸子宫内液体约10ml左右，置于保温箱内速送实验室处理。

1.2.2病原菌分离培养

（1）病原菌的好氧培养

摇匀采集的样品，用无菌棉签蘸取并均匀分别平铺于普通营养琼脂培养基、脱纤维绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基（MAC）、伊红美兰琼脂培养基（EMB）、甘露醇高盐琼脂培养基（MSA）、TTC-沙堡罗培养基，37℃恒温培养24h（沙堡罗氏培养基恒温培养48h），观察平皿上的菌落形态、大小、颜色，挑取典型菌落进行涂片，革兰氏染色、镜检，并将所有初步分离的菌株进一步纯化培养。

（2）病原菌的厌氧培养

摇匀采集的样品，用灭菌移液器枪头吸取1ml接种于硫乙醇酸盐液体培养基9ml中，置入厌氧培养袋，培养带中放入厌氧产气袋和氧气指示剂，迅速尽量挤净培养带内气体，封口，37℃恒温厌氧增菌培养72h；将厌氧增菌培养物接种厌氧固体培养基同上述方法厌氧培养72h；挑取疑似厌氧菌接种脱纤维绵羊鲜血琼脂培养基做耐氧试验，同时继续接种固体厌氧培养基厌氧培养，如同时在两种培养基上都生长，表明该菌为兼性厌氧，弃去，如在脱纤维绵羊鲜血琼脂培养基常规培养不生长而在厌氧培养基厌氧培养的情况下生长，表明该菌为专性厌氧菌，保存待菌种鉴定。

1.2.3病原菌鉴定

将已经分离纯化的菌种新鲜培养物，用灭菌0.45%氯化钠溶液制成3ml菌悬液，电子比浊仪测定菌悬液浓度，调整其浓度为BioMerieux，Inc鉴定卡要求浓度。根据革兰氏染色镜检的结果，用相对应的鉴定卡，VITEK-2-Compact15全自动微生物鉴定系统上机进行菌种鉴定。

1.2.4药敏试验

（1）菌悬液浓度调节挑取纯培养的菌落到灭菌生理盐水，用电子比浊仪测定菌悬液浓度，调节其浓度为0.5麦氏单位。

（2）菌液涂布接种和贴药敏纸片灭菌棉签蘸取菌悬液，均匀涂布在9cm普通营养琼脂培养基（链球菌属和巴士杆菌属涂布接种血清琼脂培养基），菌液吸附数分钟后，再用灭菌镊子将药敏纸片逐一贴于培养基的表面，37℃培养18h后用游标卡尺测定抑菌圈直径。

（3）药敏试验结果的判定及记录游标卡尺测定抑菌圈直径并记录。结果判定选用临床实验室标准化协会（CLSI）的标准药敏试验纸片扩散法规定（2012版）。

2　结果与分析

2.1分离鉴定结果

采自宁夏地区的180份奶牛子宫内膜炎子宫分泌物样本，共分离鉴定出细菌265株，占98.15%（265/270），其中葡萄球菌属33株，占12.22%，产色葡萄球菌、缓慢葡萄球菌等10种；链球菌3株，占1.11%，包括猪链球菌Ⅰ2株和不解乳链球菌1株；其他阳性球菌32株，占11.85%，包括鹑鸡肠球菌、毗邻颗粒链菌等13种；革兰氏阴性杆菌190株，占70.37%，包括大肠埃希菌、放射根瘤菌、少动鞘氨醇杆菌等21种；芽孢杆菌6株，2.22%；其他革兰氏阳性杆菌1株。酵母样真菌5株，占1.85%（5/270），包括克柔假丝酵母4株和热带假丝酵母1株。没有分离出专性厌氧菌。宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌的优势菌依次分别为：大肠埃希菌（55/270）、放射根瘤菌（39/270）、少动鞘氨醇杆菌（31/270）、巴斯德菌（28/270）、产色葡萄球菌（28/270）。2种以上菌混合感染样本98份，占总数54.44%（98/180）。

2.2药敏试验

从药敏试验结果可以看出：大肠埃希菌对红霉素、万古霉素、克林霉素耐药，对四环素、恩诺沙星中介，对其余17种抗菌药物表现敏感；放射根瘤菌克林霉素耐药，对氨苄西林中介，对其余20种抗菌药物表现敏感；少动鞘氨醇杆菌对阿莫西林、头孢噻肟、复方新诺明、克林霉素中介，对其余18种抗菌药物均表现敏感；巴斯德菌对复方新诺明耐药，对头孢曲松、阿莫西林、头孢噻肟、克林霉素中介，对其余17种抗菌药物均表现敏感；产色葡萄球菌对万古霉素耐药，对红霉素、恩诺沙星、复方新诺明中介，对其余18种抗菌药物均表现敏感。具体见表1。

表1 宁夏地区奶牛子宫内膜炎病原菌药敏试验　（单位：mm）

3　讨论

（1）通过对宁夏地区奶牛子宫内膜炎子宫分泌物108个样本进行病原微生物的分离鉴定后发现，分离出的微生物种类较多，但优势菌依次分别为大肠埃希菌、放射根瘤菌、少动鞘氨醇杆菌、巴斯德菌、产色葡萄球菌，特别是放射根瘤菌的分离率较高，这与国内其他学者的相关报道不同。放射根瘤菌属于根瘤菌科，土壤杆菌属，是双子叶植物和裸子植物的根瘤菌，可以与植物形成共生关系，广泛存在于土壤中，常被作为生物工程菌。一般对人不致病，但当人体免疫力低下时易造成机会感染，可引起败血症、心内膜炎、尿路感染或腹膜炎等，是人临床少见的条件致病菌[1-3］。动物实验表明，放射根瘤菌在正常情况下对动物不致病[4］，但都伴随其他致病菌在子宫内膜炎奶牛子宫分泌物检出，提示在其他致病菌感染乳腺引起奶牛子宫内膜炎，奶牛机体免疫力低下的情况下，作为一种条件性致病菌，放射根瘤菌可能成为奶牛子宫内膜炎的致病菌。关于放射根瘤菌对奶牛子宫内膜炎的致病性问题，有必要做进一步的深入研究。

（2）随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株不断增多，细菌微生物对常用抗菌药物的耐药性愈来愈强，给奶牛疫病治疗的药物选择带来很大的困难。而且有研究表明，这些存在于质粒或染色体的耐药基因可以结合方式在各菌种、动物及人类之间传播。从药敏试验结果可以看出，不同细菌对同种药物的敏感性和同种细菌对不同药物的敏感性均有差异。因此，在临床治疗程中，如选择几种比较敏感的药物合用或交替使用，可以减少单个药物的使用剂量或使用时间，减缓耐药菌株的产生。

[1]高峰平.血培养检出放射根瘤菌1例[J］.试验与检验医学，2012，30 （4）：333-336.

[2]秦洁，钱扬会.肾脏穿刺液检出放射根瘤菌1例[J］.检验医学教育，2012，19（4）：40.

[3]张月红，陆建红，陈国军，等.腹腔积液检出放射根瘤菌1例[J］.中华医院感染学杂志，2013，23（20）：5031.

[4]康晓冬，刘溪源，杨慧君，等.宁夏地区奶牛乳腺炎源性放射根瘤菌的分离鉴定与药敏试验[J］.动物医学进展，2014，35 （12）：92-95.

宁夏农林科学院科技创新先导资金项目“宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌分离鉴定及多重PCR检测方法的建立”（项目编号: NKYG-14-19）.

康晓冬（1971-），男，宁夏中宁县人，研究员，研究方向:牛羊反刍家畜疫病防制研究。