外周血TTC7B基因高表达可能作为急性心肌梗死风险评估的分子标记

郑 广，杨玉双，刘冬娜，施凯耀，孟繁波

(吉林大学中日联谊医院 心血管内科，吉林 长春130033)



外周血TTC7B基因高表达可能作为急性心肌梗死风险评估的分子标记

郑 广，杨玉双，刘冬娜，施凯耀，孟繁波*

(吉林大学中日联谊医院 心血管内科，吉林 长春130033)

冠心病(CAD)和急性心肌梗死(AMI)发病率呈逐年增高趋势，其中遗传因素在这组疾病的发病和进展中起了重要作用[1]。全基因组关联分析(GWAS)确立了多个与冠心病和急性心肌梗死疾病的相关位点，这些基因位点的功能包括炎性反应[2]、粥样斑块进展[3]、平滑肌细胞增殖[4]等。多项研究表明染色体9p21与冠心病和心肌梗死发病有关[5-7]，有报道称9p21可促进动脉粥样硬化[3]。多个基因位点(PSRC1 at 1P13.3,MIA3 at 1q41,and SMAD3 at 15q22.33)在促进或抑制细胞生长方面扮演了重要角色，这些生物学过程在动脉粥样硬化斑块进展和斑块稳定性方面起着重要作用[11]。

然而，作为冠状动脉粥样硬化性心脏病，从稳定型心绞痛(SA)向急性心肌梗死演变的过程中是否有遗传因素参与，仍不清楚。本研究通过检测TTC7B基因在AMI病人中表达量，从而明确TTC7B基因在SA向AMI转变中是否发挥作用。

1 资料及方法

1.1 临床资料

选取在2014年11月-2015年3月期间在吉林大学中日联谊医院住院的中国北方汉族人患者30人，其中稳定型心绞痛和急性心肌梗死分别为15人，并收集统计患者基线信息。所有患者均行冠状动脉造影检查明确诊断。本研究中，稳定型心绞痛诊断标准[9]和急性心肌梗死诊断标准[10]均按照最新国际指南执行。

稳定型心绞痛组15人(男∶女为9∶6)，平均年龄为58.67±6.82岁，所有患者平板运动实验阳性，冠脉造影检查显示一个及以上的冠脉分支、段狭窄≥50%；急性心肌梗死组患者15人(男∶女为11∶4)，平均年龄为58.20±9.667岁，所有患者从出现症状到入院时间均<12 h。

排除标准：两组入选者均排除静脉血栓、严重肝肾功能不全、急慢性炎症性疾病、肿瘤、血液病等。

实验方案经吉林大学中日联谊医院伦理委员会审核通过，所有患者均签署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 总RNA和总蛋白提取 使用TIANGEN TRNzol-A+ Reagent总RNA提取试剂盒进行RNA提取，使用蛋白质提取试剂盒(中国武汉博士德生物科技公司)提取新鲜血液中总蛋白，实验步骤参照说明书。使用分光光度计(Thermo NANODROP-2000)测定RNA浓度和纯度，蛋白质浓度采用BCA法测定 。

1.2.2 引物设计与合成 利用NCBI生物信息学数据库查询TTC7B基因序列，设计TTC7B基因定量引物如表1所示，由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 cDNA的合成 使用TOYOBO Rever Tra Ace试剂盒。首先对RNA进行65℃变性反应，然后按以下体系加样：RNA 7 μl(1 μg)，primer mix 0.5 μl,RT Enzyme Mix 0.5 μl,5×RT Buffer 2 μl,Total volume 10 μl。混匀后放入Applied Biosystems 9700 Thermocycler PCR仪中，37℃反应15 min，然后98℃变性5 min，迅速置于冰上，得到cDNA产物，-20℃保存备用。

1.2.4 荧光定量检测稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者外周血中TTC7B基因表达量 本实验采用SYBR-GreenⅠ染料法对TTC7B基因行实时荧光定量PCR检测。每个样品设3个重复，以GAPDH作为内参。在进行PCR反应之前，将反转录产物进行1∶10稀释，然后进行qPCR反应。Real-time PCR反应体系如下：cDNA 2 μl，PCR-Master Mix 10 μl，PCR-F-Primer 0.5 μl，PCR-R-Primer 0.5 μl，RNase free H2O 7 μl，Total volume 20 μl。充分混匀，并放入八连管中离心20 s后，放入Mx3005P荧光定量仪中进行扩增反应。反应条件为95℃预变性1 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环，反应结束之后，记录 60℃-95℃温度范围内的熔解曲线及扩增曲线，产物4℃保存备用。数据由Mx3005P荧光定量PCR仪随机附带软件计算得出。用 2-△△CT法进行相对定量的计算，所得数据用 SPSS23.0 软件统计分析。

1.2.5 蛋白免疫印迹技术检测心梗患者和冠心病患者中TTC7B基因表达量 随机从所选患者中抽取6名患者，分别为3名心梗患者和3名冠心病患者进行蛋白质提取，将提取的蛋白质通过BCA法进行总蛋白浓度的测定，并且使用内参基因β-Actin进行蛋白均一性标定，最终通过western blot及灰度值分析来确定心梗患者和冠心病患者中TTC7B基因表达量的高低。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 23.0进行统计分析，计量资料采用t检验，用均数±标准差进行统计描述；计数资料采用卡方检验或fisher检验，用频数和率进行统计描述；如P<0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病人的基线资料 如表2所示，两组患者在性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、胆固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平、是否合并高血压、是否合并糖尿病均无显著差异(P>0.05)。

表2 病人基线资料统计分析

注：*为fisher检验

2.2 RNA提取结果 经2%的琼脂糖凝胶电泳检测(如图1)，RNA提取效果较好，没有降解。

2.3 TTC7B基因mRNA的表达量检测 qPCR溶解曲线和扩增曲线表明(如图2)，TTC7B基因和内参基因GAPDH扩增条带单一，无引物二聚体和非特异性条带，扩增效率较好。从冠心病患者和心梗患者检测结果可以看出，TTC7B基因在心梗患者的表达量为冠心病患者的3.24倍(如图3)(P<0.01)。

注：泳道1-4为RNA的提取结果，M为DL2000 marker

图2 TTCTB基因和GAPDH基因溶解曲线和扩增曲线

2.4 TTC7B基因蛋白表达量检测 经过蛋白质免疫印迹检测表明，内参基因β-Actin条带均一，蛋白表达量一致，说明总蛋白上样量一致。而TTC7B基因在心梗组患者中表达水平高于冠心病组患者(如图4)。

图3 TTCTB基因的mRNA表达量 图4 TTC7B基因的蛋白质表达量

3 讨论

本研究表明TTC7B基因在AMI患者外周血中表达量为SA组的3.24倍。同时，我们在蛋白表达水平也证实了该结果。与SA相比，TTC7B基因在AMI病人外周血中表达量增高，我们推测TTC7B基因可能参与了AMI的发病，在动脉粥样硬化性心脏病由稳定型心绞痛向急性心肌梗死转变过程中起了作用。

一般认为，冠心病和急性心肌梗死为“同一种疾病”，表现为两者均存在冠状动脉狭窄，而急性心肌梗死是在冠心病基础上发生的粥样斑块破裂或持续痉挛，堵塞冠脉造成远端心肌的持续缺血、缺氧而发生坏死，常可导致恶性心血管事件发生，其致死率高。急性心肌梗死是冠心病最严重的临床表型，两者之间有着共同的危险因素,如糖尿病、高胆固醇血症、高血压、BMI、吸烟、肥胖、高脂饮食等[11]，这些危险因素对CAD和AMI的发病起了重要作用。然而，本研究中的2组病人性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、胆固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平以及是否合并高血压病、是否合并糖尿病均无显著差异(P>0.05)。因此，可以明确，TTC7B基因独立于上诉已知危险因素，可能是AMI发病的又一独立危险因素。我们可以合理推测，TTC7B基因对冠状动脉粥样硬化性心脏病由SA向AMI转变起了作用，因此，该基因可能作为评估AMI发病的基因危险因素。

全基因组关联研究发现，TTC7B基因在心脑血管疾病的发生过程中存在重要的作用，在葡萄牙人和西班牙人的缺血性中风群体中，TTC7B基因第5、6内含子中单碱基突变的频率相对较高[12]。也有研究表明，TTC7B基因的甲基化会加速机体老化，从而引起心血管机能的退化[13]。CHIKV会导致少数患者出现脑膜脑炎、心肌炎及皮肤黏膜出血等症状，TTC7B与CHIKV蛋白的结合会有效的提高CHIKV的作用效率[14]。

Otowa T等研究发现，TTC7B基因在焦虑症的发生过程中可能存在调节作用[15]，而焦虑症是导致冠心病发生的重要因素之一[16]。然而，本研究所选病人均未行心理检测，尚不能明确是否因为焦虑导致了AMI的发病。

在对正常小鼠与肥胖性小鼠模型的比较中得知，TTC7B基因在两种动物模型中的表达量差异性显著，从而表明TTC7B基因可能是肥胖病发生的一个重要的调节因子，并且在导致肥胖发生的同时也会引起血管内皮生成发生变化，最终导致肥胖病人血管疾病的发生[17]。肥胖是心血管疾病的危险因素之一，对心血管事件的发生起了重要作用。本研究中的病人BMI基线值无显著差异，因此，TTC7B基因促使SA向AMI转变过程的机制，与其影响肥胖的机制可能无关。

TTC7B是TPR基因家族中的一员。TPR是由34个氨基酸组成的重复序列，其结构域常形成螺旋-转角-螺旋结构，并在其内部形成空隙[18，19]。这些TPR结构一般作为大分子复合物蛋白相互作用的组件，并涉及到多种细胞生物学过程，如转录调节、mRNA修饰、蛋白折叠及转移等[20]。然而，目前为止TTC7B的功能尚不明确。

在本研究中，我们首次发现在冠状动脉粥样硬化性心脏病中，TTC7B基因在SA和AMI均有表达，但与SA相比，TTC7B基因在AMI组表达升高，我们合理推测TTC7B基因参与了AMI的发病。然而，TTC7B基因导致AMI发病是否合并上述机制尚不得知，因此，对TTC7B基因进一步研究尤为必要。

致谢：我们衷心感谢吉林大学畜牧兽医学院赵志辉教授和他的研究团队对本实验的技术指导。

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2008年教育部新世纪优秀人才、2004年度吉林省杰出青年科学研究计划、吉林省科技厅项目(20090734)、吉林省财政厅项目(2012009)

1007-4287(2016)10-1723-04

2015-08-17)

*通讯作者