CKB在大肠癌中的表达及意义

李时孟,何成彦,谢 风,高 申*,杨照微,郭宏华,黄丽红

(吉林大学中日联医院 1.检验科；2.消化内科；3.老年病科，吉林 长春130033)



CKB在大肠癌中的表达及意义

李时孟1,何成彦1,谢 风1,高 申1*,杨照微1,郭宏华2,黄丽红3

(吉林大学中日联医院 1.检验科；2.消化内科；3.老年病科，吉林 长春130033)

目的 探讨脑肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)在大肠癌组织中的表达水平及临床意义。方法 应用二维色谱及质谱联用技术分析18例大肠癌患者肿瘤标本，筛选出在大肠癌肿瘤组织和癌旁组织差异表达的蛋白CKB，免疫印迹技术加以印证。结果 质谱鉴定显示CKB在肿瘤组织中较癌旁组织低表达，免疫印迹印证了其准确性。结论 CKB的低表达在调节肿瘤的发生、发展中起到一定作用。

脑肌酸激酶；大肠癌；液质联用

(ChinJLabDiagn,2016,20:1646)

脑肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)是一类在细胞质中调控能量代谢的酶，国内外有学者指出CKB与肿瘤的发生、发展关系密切[1-7]。本文采用液质联用技术及免疫印迹技术，旨在研究CKB在大肠癌及癌旁组织中的差异表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本采集 共收集结直肠科手术切除的18例新鲜的组织标本。以上标本经病理学诊断均为DukesB期腺癌。所有患者手术前均未接受辅助放化疗。手术中获得的癌旁正常组织距癌边缘大于10厘米，且均取自癌组织上端。待标本离体后，立即取材，液氮速冻，-80℃保存。

1.2 相关仪器及试剂 液相色谱分析仪由安捷伦公司提供，LTQXL离子肼质谱仪由赛默飞世尔公司提供。蛋白质定量试剂盒(RCDC Protein Assay Kit)购于Bio-Rad公司。DNA酶和RNA酶均购自 Sigma 公司。DTT及TPCK修饰所用的测序级胰酶购自Promega公司。实验用水均由 Milli-Q 超纯水发生装置产生，电阻率保持在18 MΩ·cm。

1.3 方法

1.3.1 总蛋白提取和蛋白浓度检测 将组织样品从-80℃冰箱中取出，加入液氮研磨粉碎。每100 mg组织中加裂解缓冲液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v)3 -[(3 -胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，25 mmol/L精胺，2 mmol/L苯甲基磺酰氟 ，65 mmol/L DTT)200 μl，室温下振荡1 h，并加入DNA酶和RNA酶用以去除DNA和RNA。10℃，100,000 g，离心1 h，吸取上清备用。用考马斯亮蓝染色，在595 nm条件下应用核酸蛋白分析仪测吸光度，采用标准曲线法得出各组蛋白浓度，于-80℃保存备用。

1.3.2 蛋白水解多肽混合物制备 取出-80℃保存的蛋白质样品，平衡室温，取3倍体积的25 mmol/L NH4HCO3对样品进行稀释，调整尿素浓度低于2 mol/L。加入1 mol/L DDT混匀使其终浓度控制在20 mmol/L，置于56℃条件下还原1 h，待反应物降至室温，加1 mol/L碘乙酰胺，调整终浓度至50 mmol/L，常温条件下避光30 min。按1∶50比例加入测序级胰酶，放入37℃水浴箱中过夜，酶切产物，真空抽干后-80℃保存。

1.3.3 二维色谱和质谱联用分离及鉴定多肽混合物 取出上述样品于0.1%甲酸中溶解，每次实验取50 μg样品上样，行二维液质联用分析，多肽经反相色谱洗脱后，应用LTQ XL质谱仪检测，质核比检测在400-2000 amu范围内。对强度大于10个单位或有10个以上离子信号的谱图，进一步进行SEQUEST算法并用Bioworks 3.3.1 SP1软件包进行数据库检索，鉴定相关的多肽及蛋白。进行鉴定的蛋白数据库是从欧洲生物信息学院网站(http://www.ebi.ac.uk/IPI/)中下载的人蛋白质数据库(3.51版) 。

1.3.4 免疫印迹分析 在样品中加入等量 2×载样液，100℃条件下煮沸5 min，常温10 000 r/min离心5 min。取20 μl上清液加入至10% SDS-PAGE，恒压 200 V电泳40 min。将凝胶放在0.025% 考马斯亮蓝R-250染液中震荡染色1 h，后在7%乙酸，50% 甲醇的水溶液中脱色1 h，再置于20% 甲醇，5% 甘油中过夜，用醋酸玻璃纸干燥备用。将凝胶切胶后平放于纤维素膜上进行转膜，电流设定为100 mA转移1 h。转移结束后，冲洗转移膜再放入2%BSA封闭液中1h，冲洗两次，将转移膜与5 μl /ml 浓度的一级抗体加入杂交袋振摇1 h。洗膜后加入二级抗体反应1小时。再次洗膜后，加底物反应5 min即可。

2 结果

2.1 肿瘤组织和癌旁组织中总蛋白酶解混合物的二维色谱及质谱联用分析结果 在肿瘤组织酶解混合物的多肽质谱数据中，共鉴定了29 825个多肽序列，得出860个蛋白质鉴定数据。在癌旁组织的多肽质谱数据中，共鉴定了40 388个多肽序列，得出549个蛋白质鉴定数据。

2.2 肿瘤组织和癌旁组织中差异蛋白质谱分析 在差异蛋白鉴定中，谱图数据需同时满足两样品比值≥1及两样品差值≥72，为避免假阳性的发生，每种样品均行三次实验而后将三组结果比较分析。共得到44个差异蛋白，其中21个上调蛋白，23个下调表达。CKB质谱图见图1。

图1 CKB质谱图

2.3 CKB免疫印迹结果

免疫印迹试验证实CKB在癌组织中表达下调，而在癌旁组织中高表达，见图2。

图2 CKB免疫印迹图

3 讨论

大肠癌发病隐匿，初期无典型临床表现，大多数患者发现时已进入中晚期，即便手术治疗并辅以放化疗，大肠癌的5年生存率仅为50%[7]。因此，早期诊断仍为大肠癌的研究重点。随着检验技术的不断发展，蛋白质组学可用于分析蛋白质的组成、表达水平及修饰状态，通过比较肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白表达，可发现高灵敏度、高特异性的肿瘤标志物[8]。

在脊椎动物的细胞中，肌酸激酶( creatine kinase，CK)是一类很重要的激酶，它可以精确地调节体内能量平衡，维持细胞内ATP水平稳定[9]。CKB是肌酸激酶的一个亚型，广泛存在于骨骼肌、心肌、神经组织及线粒体中，参与能量信号传导过程，可逆性地催化磷酸肌酸的高能磷酸键与ADP结合而生成ATP和肌酸[10]。很多学者针对CKB在肿瘤发生及肿瘤进展中所参与的能量代谢途径进行研究，Loo[11]等的研究表明CKB的高表达是大肠癌肝内转移的机制之一，他指出在肝细胞内的乏氧微坏境中，CKB在 miR-483 及miR-551a的调控下催化磷酸肌酸转变为ATP，为扩散至肝脏的肿瘤细胞供能。Ruginis[12]等在研究中发现胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)及其受体(GRPR)在大肠癌中异常高表达，而在表达GRP/GRPR的细胞系中CKB显著低表达，考虑CKB可缩短肿瘤细胞的生存期。此外，在肺鳞癌、肾癌及胶质瘤中均有研究显示CKB为下调表达[10，13，14]。而Zeng[15]等在对肺鳞癌的研究中得到了不同的结果，CKB在肿瘤组织中显著上调并可作为早期诊断的新型肿瘤标志物。Chen[16]等和Li[9]等的研究也分别指出CKB在前列腺癌及卵巢癌中均为上调蛋白。

在本研究中，CKB在大肠癌组织中显著下调表达，随后进行的免疫印迹试验也证实了CKB在癌组织中下调表达，而在癌旁组织中高表达。在以往的研究中，CKB已在多种恶性肿瘤中发现异常表达。虽然表达结果并不一致，但足以说明CKB在肿瘤的发生、发展过程中起到一定的作用，但其具体机制还需进一步研究。

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Creatine kinase B-type Expression in Colorectal Carcinoma and its Clinical Significance

LIShi-meng,HECheng-yan,XIEFeng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To detect the expression of creatine kinase B-type(CKB) in colorectal carcinoma and its clinical significance.Methods Samples of 18 patients with colorectal carcinoma were analyzed using two-dimensional chromatography and mass spectrometry technology to find differentially-expressed protein peaks including CKB,then CKB was tested by Western blotting.Results Identifications by mass spectrometer showed that CKB in adjacent tissues was significantly higher than that in colorectal carcinoma tissues,we also use Western blotting to conform the results.Conclusion The low expression of CKB is closely related with oncogenesis and progression of colorectal carcinoma.

Creatine kinase B-type(CKB);colorectal carcinoma;LC-MS

国家自然科学基金(81572082)；吉林省科技厅基金(20140311092YY，20150101153,20150414015)

1007-4287(2016)10-1646-03

R735.3+4

A

2015-07-23)

*通讯作者