Bcl-2抑制剂ABT737增加GSK3抑制剂SB216763引起的A549细胞凋亡

石少敏，王 静，于杜娟，赵永娟

(吉林大学中日联谊医院 呼吸内科，吉林 长春130033)



*通讯作者

Bcl-2抑制剂ABT737增加GSK3抑制剂SB216763引起的A549细胞凋亡

石少敏，王 静*，于杜娟，赵永娟

(吉林大学中日联谊医院 呼吸内科，吉林 长春130033)

目的 探讨SB216763联合ABT737对肺癌细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法 MTT法检测SB216763或联合ABT737对A549细胞增殖的影响。流式细胞术检测SB216763或联合ABT737 对A549 细胞凋亡的影响。Western blot检测各组内的cleaved caspase3和cytochrome C蛋白表达水平。结果 SB216763抑制了A549细胞的增殖，且呈现剂量依赖性。ABT737增强了SB216763对A549细胞的抑制作用。流式细胞仪结果表明ABT737增强了SB216762诱导的细胞凋亡。Western blot 结果表明SB216763上调了cleaved caspase3和cytochrome C蛋白的表达,与SB216763组相比，联合用药处理的细胞中cleaved caspase-3和cytochrome C的表达显著增加。结论 ABT737增强A549细胞对SB216763的敏感性，为肺癌的治疗提供新靶点。

SB216763；ABT737；肺癌细胞；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1619)

糖原合酶激酶3(GSK3)是一种可以磷酸化糖原合成酶并使之失活的一种酶，已有研究证明GSK3对于很多癌症的发生发展至关重要，包括非小细胞肺癌，抑制GSK3能阻碍细胞的增殖并诱导其凋亡[1]。只通过抑制单一靶点虽然在短期内效果明显，但肿瘤会很快对该药产生耐受性，影响了其治疗的效果。多靶点策略治疗癌症已经展现了很好的治疗效果，标志着癌症的治疗进入了多靶点时代[2]。Ren T等人研究报道Bcl-2在肺癌中高表达，并发挥着促存活的作用[3]。本文探讨抑制Bcl-2在GSK3抑制剂SB216763诱导肺癌细胞A549中的作用，为临床治疗非小细胞肺癌提供了很好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用的人非小细胞肺癌A549细胞株购自美国 ATCC，RPMI 1640培养基、胎牛血清由Hyclone 公司提供。GSK3抑制剂SB216763和MTT(四甲基偶氮唑蓝)均购自美国Sigma公司，ABT737购于AbMole BioScience公司。一抗cleaved caspase-3、cytochrome C及相应的二抗购自于自美国Santa Cruz公司。PVDF膜(0.45 μm)购于Millipore 公司。

1.2 细胞培养

培养人非小细胞肺癌A549细胞用含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各100 U/ml的RPMI 1640 培养液培养，置于温度为37℃,CO2浓度为5%、饱和湿度的培养箱中培养。每天换液一次，待细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰酶进行消化，按1∶4比例进行传代，待细胞传至第三代后进行实验。

1.3 细胞毒性试验检测

MTT法检测不同浓度SB216763(0,10 20 30 μM)和联合用药组对人非小细胞肺癌A549增殖率的影响，酶标仪检测每孔光密度(OD)值(570 nm波长)。测三次取平均值，按公式计算细胞存活率。每次实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测

细胞经不同处理后24 h，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化、收集总细胞，用预冷 PBS液洗涤2次，每次5 min，弃上清。先加入400 μl结合缓冲液，重悬细胞，制成单细胞悬液，再加入6 μl Annexin V-FITC，最后加入 4 μl PI，室温避光孵育15 min后上机检测。

1.5 Western blot检测

Western blot检测人非小细胞肺癌A549细胞中凋亡蛋白质的表达水平。①细胞总蛋白的提取：细胞给药作用24小时后，用胰酶消化收集到离心管中，加入预冷的PBS(1 ml)，1 000 rpm/min，室温离心两次，每次5 min。取上清转移到1.5 ml离心管中，混匀后，4℃，3 000 rpm/min再次离心。倒净上清，每管加入200 μl-300 μl RIPA 蛋白裂解液(含1%PMSF)，超声5 s左右打碎基因组后4℃放置45 min(以上全程冰上操作)。之后用4℃、4 000 rpm/min离心，离心15 min，取上清检测蛋白浓度，按体积比例加入一定量的5× loading Buffer，98℃煮沸10 min使蛋白变性,然后37℃放置10 min冷却处理后存放在-20℃冰箱保存。②采用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后结合一抗(cleaved caspase3和cytochrome C工作浓度为1∶1 000)，第二天加入对应的二抗(1∶1 000稀释) 室温孵育2 h，洗膜3次，一次15 min,两次5 min,加ECL显色液 进行显影，提取结果并用软件分析数据。

1.6 统计学方法

实验中的各组数据均采用M±SD表示，采用SPSS11.5软件进行统计学分析处理，进行one-way ANOVA分析；各实验组间数据的均值比较采用t检验。Western blot结果数据的分析，采用天能图像分析系统以及Quantity One软件进行分析处理。

2 结果

2.1 SB216763对A549细胞的增殖抑制效应

不同浓度的SB216763(10 μM,20 μM和30 μM)作用于A549细胞24 h,MTT法结果显示不同浓度的SB216763都可以抑制A549细胞的增殖，且随着剂量的增加，SB216763的抑制作用也会增强。见图1。

与control组比较有统计学意义，*P<0.05。

2.2 SB216763诱导了A549细胞的凋亡

流式细胞仪检测分析结果显示不同浓度的SB216763刺激A549细胞24 h后，细胞的凋亡率有所增加，且呈现剂量依赖性的方式。见图2。

与control组比较有统计学意义，*P <0.05。

2.3 SB216763增加了A549细胞内cleaved caspase-3的表达

Caspase 3正常以酶原形成存在于胞浆内，在凋亡的早期阶段，它会被激活并被剪切成cleaved caspase-3。Western blot结果表明了在对照组内cleaved caspase-3的表达量非常低，不同浓度的SB216763都能诱导细胞内该蛋白的表达。见图3。

2.4 SB216763增加了A549细胞内cytochrome C的表达

Western blot结果表明了在对照组内cytochrome C的表达量非常低，不同浓度的SB216763都能诱导细胞内该蛋白的表达。见图4。

与control组比较有统计学意义，*P<0.05。

与control组比较有统计学意义，*P<0.05。

2.5 ABT737增强SB216763对A549细胞增殖抑制效应

实验分为四组：control组，SB216763组，ABT737组及联合用药组。我们实验的前期结果表明了ABT737对A549细胞的最大无毒剂量是5 μM。因此，在后续实验中我们选择ABT737的剂量为5 μM。根据图1的结果，我们使用SB216763的剂量为20 μM。实验结果表明与SB216763组相比，联合用药组抑制了A549细胞的增殖。见图5。

与control组比较有统计学意义，* P<0.05。

2.6 ABT737增强SB216763诱导的A549细胞凋亡

流式细胞仪检测联合用药对A549细胞凋亡的变化情况，结果表明SB216763联合ABT737组能明显增强SB216763诱导的A549细胞凋亡。见图6。

与control组比较有统计学意义，*P<0.05，与SB216763组比较有统计学意义，#P<0.05。

图6 SB216763联合ABT737 对A549细胞凋亡的影响

2.7 ABT737增强SB216763诱导的A549细胞内cleaved caspase-3的表达

Western bolt 检测四组细胞内cleaved caspase-3的蛋白表达水平，结果表明对照组和ABT737组内cleaved caspase-3的表达量很低，与SB216763组相比，联合用药组能增加cleaved caspase-3的表达。见图7。

与control组比较有统计学意义，*P<0.05，与SB216763组比较有统计学意义，#P<0.05。

2.8 ABT737增强SB216763诱导的A549细胞内cytochrome C的表达

Western bolt 检测四组细胞内cytochrome C的蛋白表达水平，结果表明对照组和ABT737组内cleaved caspase-3的表达量很低，与SB216763组相比，联合用药组能增加cytochrome C的表达。见图8。

与control组比较有统计学意，*P<0.05，与SB216763组比较有统计学意义，#P<0.05。

3 讨论

GSK3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶(T),GSK3最初是在小鼠骨骼肌中分离纯化出来的，它可以磷酸化糖原合成酶(糖原合成最后一步的关键酶)并使之失活。GSK3主要有两种亚型，即GSK3α和GSK3β，它们广泛地在组织中表达。GSK3α编码51 kDa的多肽，GSK3β编码47 kDa的多肽。GSK3是一个与众不同的激酶，它在静息状态的细胞内处于激活的状态；而GSK3a的S21位点和GSK3b的S9位点的丝氨酸磷酸化可以诱导GSK3处于失活状态[4，5]。最初，关于丝氨酸/苏氨酸激酶糖原合成酶3(GSK3)的研究，科学家们主要集中在调控糖原合成方面。随后，研究人员发现GSK3在许多疾病中发挥着调控作用，比如癌症、衰老、免疫失调、帕金森症以及代谢紊乱等等。因此，GSK3可作为一个治疗癌症和其他疾病的潜在的靶点[6]。SB216763是GSK3的一种特异性抑制剂。我们的研究结果表明了SB216763抑制了肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。

Bcl-2是Bcl-2家族蛋白成员之一，在促存活过程中发挥着关键作用。Bcl-2蛋白主要定位在线粒体、内质网以及核周围，其在胚胎组织中广泛地表达。许多研究已表明Bcl-2基因的高表达与人肿瘤的恶性程度呈现正相关的关系[7-9]。Bcl-2的高表达也会导致癌症患者的预后不良[8]。ABT737是Bcl-2的抑制剂，它主要通过抑制Bcl-2与其他蛋白的结合从而抑制了Bcl-2的功能。James Witham等人研究表明ABT737增强了卵巢癌对化疗药物的敏感性[10]。而在我们的实验中，Bcl-2抑制剂ABT737增加肺癌细胞对GSK3抑制剂的敏感性。

总之，我们的实验结果表明GSK3抑制剂SB216763以剂量依赖性的方式抑制肺癌细胞A549的增殖并促使其凋亡，与Control组相比，Bcl-2抑制剂ABT737单独作用对细胞增殖和凋亡没有影响。而ABT737能增加A549细胞对SB216763的敏感性，这为临床治疗非小细胞肺癌提供了理论支持。接下来，我们课题组将深入探讨ABT737在SB216763诱导A549细胞凋亡中的分子机制。

[1]Vincent EE,Elder DJ,O'Flaherty L,et al.Glycogen synthase kinase 3 protein kinase activity is frequently elevated in human non-small cell lung carcinoma and supports tumour cell proliferation[J].PLoS One,2014,9(12):e114725.

[2]Dar AC,Das TK,Shokat KM,et al.Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology[J].Nature,2012,486(7401):80.

[3]Ren T,Shan J,Li M,et al.Small-molecule BH3 mimetic and pan-Bcl-2 inhibitor AT-101 enhances the antitumor efficacy of cisplatin through inhibition of APE1 repair and redox activity in non-small-cell lung cancer[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:2887.

[4]Beurel E,Grieco SF,Jope RS.Glycogen synthase kinase-3(GSK3):regulation,actions,and diseases[J].Pharmacol Ther,2015,148:114.

[5]Woodgett JR.Molecular cloning and expression of glycogen synthase kinase-3/factor A[J].EMBO J,1990,9(8):2431.

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[10]Witham J,Valenti MR,De-Haven-Brandon AK,et al.The Bcl-2/Bcl-XL family inhibitor ABT-737 sensitizes ovarian cancer cells to carboplatin[J].Clin Cancer Res,2007,13(23):7191.

Bcl-2 inhibitor ABT737 enhances A549 cell sensitivity to GSK3 inhibitor SB216763

SHIShao-min,WANGJing,YUDu-juan,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore the effect of ABT737 on SB216763 induced A549 cell apoptosis and its underlying mechanism.Methods The effect of SB216763 alone or combined with ABT737 on A549 cells proliferation was employed by MTT assay.Cell apoptosis rate was examined by flow cytometry analysis.Western blot was employed to analyze the protein levels of cleaved caspase-3 and cytochrome C in different groups.Results The proliferation of human lung cell can be inhibited by SB216763 in a dose-dependent manner and ABT737 enhanced the inhibitory effect of SB216763.The flow cytometry data revealed that ABT737 could cause an increase in the apoptosis rate induced by SB216763.Western blot showed SB216763 increased the expression of cleaved caspase-3 and cytochrome C in A549 cell,and when SB216763 and ABT737 were combined,the expression of cleaved caspase-3 and cytochrome C were markedly enhanced.Conclusion ABT737 enhanced the sensitivity of A549 cells to SB216763,providing a new target for lung cancer theragy.

SB216763;ABT737;lung cell;apotosis

1007-4287(2016)10-1619-05

R734.2

A

2015-11-15)