负载抗原的DC及DC-CIK对小细胞肺癌杀伤作用的比较研究

赵 鑫，常 颖，刘玉侠，赵 晖，卢卫平，于 鸿，王启文*

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012)



*通讯作者

负载抗原的DC及DC-CIK对小细胞肺癌杀伤作用的比较研究

赵 鑫1，常 颖1，刘玉侠2，赵 晖1，卢卫平1，于 鸿2，王启文1*

(1.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012)

目的 探讨负载抗原的树突状细胞(Dendritic cells,DC)以及DC联合CIK细胞(cytokine induced killer cells)对小细胞肺癌细胞株NCIH-446的杀伤作用，为DC、CIK应用于小细胞肺癌的治疗提供实验数据。方法 体外培养DC、CIK细胞，并将NCIH-446提取的抗原负载到DC，同时将DC与CIK联合培养，将负载抗原的DC(DC-Ag)及DC-CIK与NCI446按50∶1的比例进行杀伤活性实验，检测培养不同时间的两种细胞对NCIH-446的杀伤作用。结果 DC-Ag及DC-CIK在与NCIH-446CIK共同培养2个小时就监测到了两种细胞对NCIH-446的杀伤作用，而且随着时间的推移，杀伤作用逐渐增强，DC-Ag从2小时的57.63%提高到48小时的90.78%，而DC-CIK从62.95%提高到了91.57%，显示了两种细胞强大的杀伤作用，而且这种作用随着时间的延长效果越明显。结论 负载抗原的DC及DC-CIK对小细胞肺癌细胞株NCIH-446有极强的杀伤活性，为临床小细胞肺癌的治疗提供了一种新的方法。

树突状细胞；细胞因子活化杀伤细胞；小细胞肺癌，杀伤活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1627)

在肺癌的发病率中，小细胞肺癌所占的比例不是很高，大约13%左右[1]。但其生长迅速，侵袭性要强于非小细胞肺癌，易发生早期转移，预后较差，生存期较短[1,2]。小细胞肺癌对化疗极为敏感，据报道经化疗后的病人RR可达60%-90%，CR可达30%-40%[3],但极易发生复发和转移，所以如何预防化疗后的复发和转移，提高病人的生存期和生活质量，是小细胞肺癌治疗成功的关键，也是目前治疗的难题。生物治疗近年来以其对肿瘤的强大杀伤力以及对肿瘤病人免疫功能的恢复和提高效果被用于肿瘤的治疗。本实验选择生物治疗中的DC负载抗原以及DC、 CIK联合培养对小细胞肺癌进行体外杀伤实验，为小细胞肺癌的治疗提供一种除化疗外的治疗手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴细胞分离液 天津灏洋生物制品科技责任有限公司；GM-CSF，TNF-α，IL-4Peprotech公司;IMDM培养基GIBCO公司；胎牛血清天津康源公司； IL-2北京四环生物制药有限公司；anti-CD3Ab Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE购自 BD公司；IFN-γ天津灏洋生物制品科技责任有限公司；CD3+、CD4+、NK、NKT、CD3+HLA-DR+、CD8+CD28+荧光标记单克隆抗体购自美国BECKMAN COULTER公司。

1.1.2 小细胞肺癌细胞株NCIH-446 吉林省肿瘤防治研究所保存。

1.1.3 实验设备 实时无标记细胞功能分析仪XCELLigence RTCA S16，E-Plate16细胞检测板北京昊诺斯科技有限公司提供；低温高速离心机SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培养箱Thermo Scientific公司；流式细胞仪BD公司。

1.2 方法

培养NCIH-446细胞：将冻存的NCIH-446细胞复苏、培养至对数生长期，用0.25%胰酶进行消化后，调细胞数为6×104/ml,备用。首先将E-Plate16细胞检测板中加50 μl培养液测量基线，然后再加已调好细胞数的NCIH-446，100 μl/孔，放入xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪中，并将其放到37℃，5%CO2培养箱进行培养24小时。效应细胞DC、CIK的制备及鉴定，见参考文献[4,5]。NCIH-446肿瘤抗原的制备见参考文献[6]。将培养6天的DC加入NCIH-446提取的抗原[5]与DC-CIK按1∶1的比例共同培养3天，分别调细胞数为3×106/ml，备用。将加入NCIH-446的E-Plate16细胞检测板从37℃，CO2培养箱中取出，按以下设计加入已调好细胞数的负载抗原的DC及DC-CIK细胞，每孔100 μl，放入xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪中，再将其放回到37℃，5%CO2培养箱中，对杀伤活性进行实时监测。本实验共监测了48小时，每15分钟监测1次。分三组，第1组:NCIH-446； 第2组:DC-Ag+NCIH-446(50∶1)；第3组;DC-CIK+NCIH-446(50∶1)。

1.3 统计学分析

应用SPSS17.0进行统计学分析，实验数据以均值±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

DC-Ag、DC-CIK对NCIH-446的杀伤效应的监测结果见图1。整个实验进行了72小时，其中杀伤实验从24小时开始进行，共进行了48小时。从图中可以看出，DC-Ag、DC-CIK与NCIH-446共培养后NCIH-446的CI迅速下降，并且一直维持到本实验结束。从监测的结果中选取了以上的时间点进行统计分析，见表1。结果证明DC-Ag及DC-CIK对NCIH-446的杀伤效应从2小时开始显现，而且随着时间的推移，杀伤效果不断提高，到实验结束时最高达都达到90%，而且6小时，13小时，24小时35小时，48小时DC-CIK及DC-Ag 与2小时的杀伤活性比有明显差异(P<0.01)，而DC-CIK与DC-Ag相比在同一时间点对NCIH-446的杀伤效应统计学上没有差异。

红色为NCIH-446，绿色为DC-Ag+NCIH-446，蓝色为DC-CIK+NCIH-446

3 讨论

小细胞肺癌在肺癌的发病率中虽然不是很高，但是其发展速度快，侵袭性强，治疗后的复发率和转移率高，因此预后往往很差。虽然化疗对小细胞肺癌的治疗可以快速起效，但其复发转移速度也较其它类型肺癌快，严重影响了它的预后和生存期。目前生物治疗在肿瘤的综合治疗中发挥着重要作用，它可以直接杀伤肿瘤细胞，提高免疫功能，尤其对清除放化疗后残存的肿瘤细胞[7]，预防转移和复发具有较好的作用。

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前发现功能最强的专职抗原递呈细胞，可以激活CD8+T杀伤细胞以及CD4+T辅助细胞，在免疫应答反应中起着重要作用[8]。CIK是一种广谱的抗肿瘤细胞，它具有杀伤性强，无MHC限制的特点。本实验选用抗原负载的DC(DC-Ag)及DC联合CIK对小细胞肺癌细胞NCIH-446进行杀伤活性实验，通过xCELLigence RTCA S16实时无标记细胞功能分析仪进行实时监测，结果证明，DC-Ag 、DC-CIK与NCIH-446在效靶比为50:1时，在共同培养2小时时就产生了较强的杀伤效果，而且随着培养时间的延长，杀伤效果不断提高(见图1，表1)，维持了对肿瘤杀伤的持续效应，两种细胞在培养48小时杀伤率都达到了90%以上，证明了抗原负载的DC及DC联合CIK对小细胞肺癌强大的杀伤活性。但在同一时间点两种细胞对NCIH-446的杀伤作用没有明显差异。

表1 DC-Ag、DC-CIK对NCIH-446的杀伤效应

※P<0.01,与2小时相比，△P<0.01与2小时相比

[1]Van Meerbeeck JP,Fennell DA,De Ruysscher DK.Small- cell lung cancer[J].Lancet,2011,378(9804):1741.

[2]Dooley AL,Winslow MM,Chiang DY,et al.nuclear factor I/B is an oncogene in small cell lung cancer[J].Genes Dev,2011,25(14):1470.

[3]廖美琳，王慧敏.小细胞肺癌的治疗进展[J].肿瘤，2001,21(6)：399.

[4]赵 鑫，常 颖，刘玉侠，等.培养不同时间CIK细胞免疫表型变化与其抗肿瘤活性关系的研究[J].中国实验诊断学，2015,19(9)：1455.

[5]于 鸿，刘玉侠．热休克蛋白抗原肽致敏的脐血树突状细胞治疗肺癌的实验研究[J].中国实用医药，2007,2(35)：18.

[6]于 鸿，张 健，刘玉侠，等.抗原致敏的脐血树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外实验研究[J].中国实验诊断学，2010,14(1)：107.

[7]刘清池，张慧敏，张玉娜，等.DC-CIK细胞清除微小残留白血病的临床研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013,20(4)：398.

[8]Gilboa E.DC-based cancer vaccines[J].J China Invest,2007,117:1195.

The compare study of antigen-pulsed DC and DC united CIK on Small cell lung cancer

ZHAOXin,CHANGHing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012，China)

Objective Investigate the killing effect which antigen-pulsed Dendritic cells(Dendritic cells,DC)and DC united CIK cells(cytokine induced killer cells)have on small cell lung cancer cell lines NCIH-446 and provide the experimental data for the DC,CIK used in the treatment of small cell lung cancer.Methods Culture the DC,CIK cells in vitro,load the antigen extracted from NCIH-446 to DC,co-culture DC and CIK at the same time,do the experiment of killing activity making the antigen-pulsed DC(DC-ag)and DC-CIK in a 50:1 properation with NCIH-446,detective killing effect of two cells in different culture time on NCIH-446.Results The killing effect which DC-Ag and DC-CIK have on NCIH-446 can be surveyed after 2 hours' co-culture and the killing effect increases gradully over time,DC-Ag increases from 57.63% to 90.78% within 46 hours and DC-CIK increases from 62.95% to 91.57%,which shows the great killing effect of the two cells,the effect becomes more obvious over time.Conclusion Antigen-pulsed DCs and DC-CIK have strong killing activity on small cell lung cell line NCIH-446,which provides a new method for the clinical treatment of small cell lung cancer.

dendritic cells;cytokine activated killer cells;small cell lung cancer;killing activity

1007-4287(2016)10-1627-03

R734.2

A

2015-04-11)