洛铂抑制膀胱癌细胞增殖及诱导凋亡机制的研究

王 丰，于 倩，王 华

(吉林大学中日联谊医院 药剂科，吉林 长春130033)



洛铂抑制膀胱癌细胞增殖及诱导凋亡机制的研究

王 丰，于 倩*，王 华*

(吉林大学中日联谊医院 药剂科，吉林 长春130033)

目的 研究洛铂对人膀胱癌细胞的抑制作用，并揭示其可能的作用机制。方法 体外常规培养人膀胱癌细胞株5637。利用MTT细胞增殖法检测洛铂的细胞毒性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测癌细胞的凋亡程度；通过伤口愈合实验观察细胞的迁移；通过Transwell小室测定评估洛铂对5637细胞侵袭和迁移能力的影响；利用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡基因的表达。结果 洛铂抑制人膀胱癌细胞并诱导其凋亡,下调膀胱癌5637细胞Survivin和Bcl-2的表达水平,上调其Bax和Caspase-3的表达水平。结论 洛铂的细胞毒性诱导人膀胱癌细胞凋亡，有利于洛铂对膀胱癌治疗的深入研究。

洛铂；膀胱癌；细胞凋亡；侵袭和迁移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1634)

洛铂是第三代铂类抗肿瘤制剂的代表，在临床前肿瘤模型的研究中有广泛的活性，对于某些抗顺铂和卡铂的肿瘤模型有较好的抑制作用[1]。研究表明，洛铂对不同类型的肿瘤中都具有抗肿瘤活性，其中包括黑色素瘤、肝细胞癌、大肠癌、胆管癌、卵巢癌和宫颈癌等[2-7]。本实验通过研究洛铂对人源膀胱癌(5637)细胞株的影响及其作用机制，为洛铂治疗膀胱癌的临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

洛铂购自海南长安国际制药有限公司；第一抗体Caspase-3、Survivin、Bax、Bcl-2、β-actin购自CST公司； 荧光第二抗体购自Odyssey公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、0.5%结晶紫染色液购自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel基质、RPMI-1640培养基购自Corning公司；无水甲醇、二甲基亚砜(DMSO)购自北京化工厂；吐温20购自天津光复精细化工有限公司；青霉素和链霉素(×100)、胰蛋白酶-EDTA购自Biosharp公司；胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司；蛋白测定试剂盒购自北京碧云天有限公司。

1.2 细胞的培养

人源膀胱癌(5736)细胞株购于上海中科院细胞所。细胞培养在含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素-链霉素)的RPMI-1640培养基中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

1.3 细胞增殖测定

通过显微镜计数，将细胞稀释成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μl。在37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。 弃去孔内上清液，加入含不同浓度洛铂的10%血清培养基，每组设5个平行样本，对照组加入DMSO。分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl MTT (5 mg/mL),在37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO，将96孔板放于孔板振荡器上振荡20 min。酶标仪490 nm波长下检测吸光度值(A)。计算抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。

1.4 细胞凋亡测定

用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒来分析不同浓度的洛铂对人源膀胱癌(5637)细胞的凋亡作用。简要步骤如下：将细胞(1×105个/孔)接种于6孔板中，加入含不同浓度洛铂的10%血清培养基，培养24 h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入Annexin V和碘化丙啶，暗室反应10 min。数据由流式细胞仪分析。

1.5 细胞愈合迁移

通过伤口愈合迁移的测定来评估细胞的迁移能力。当细胞培养到80%-90%时，细胞单层用无菌的200 μl枪头刮下，并加入含有不同浓度洛铂的非血清培养基，孵育24小时后，固定并拍照。

1.6 Transwell小室迁移和侵袭

根据相关文献的报道[8]，用Transwell小室(8微米孔径，Corning公司)测定细胞迁移，其中实验设计有所改进。人源膀胱癌(5637)细胞饥饿处理过夜，Transwell上室加入200 μl含有1×106个人源膀胱癌(5637)细胞的无血清培养基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培养基。上下小室都加入不同浓度的洛铂。24小时后，用棉签将上室未迁移的细胞擦去。迁移的细胞固定在甲醇中，用1%的结晶紫染色。在光学显微镜下随机选择5个视野进行计数并拍照。侵袭实验按照文献方法进行[9]。将Matrigel基质1∶30稀释，加到Transwell上室膜上，37℃、5% CO2培养箱中放置2小时。基质胶聚合后，Transwell上室加入200 μl含有1×106个人源膀胱癌(5637)细胞的无血清培养基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培养基。上下小室都加入不同浓度的洛铂。培养24小时后，用棉签将上室Matrigel基质和未迁移的细胞擦去，用1%的结晶紫染色，然后在光学显微镜下计数。

1.7 Western blot

Western blot的实验操作在之前文献基础上有所改进[10]。用含有不同浓度洛铂的10%血清培养基处理人源膀胱癌(5637)细胞24小时，用预冷的PBS洗涤两次，加入200 μl RIPA 裂解液，最后离心收集上清液的蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。加入等量样品的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，半干转到聚偏二氟乙烯(0.2 μ PVDF)膜上，然后将膜用5%的脱脂牛奶在室温孵育2小时，并在4℃下与特定的第一抗体孵育过夜，PBS洗涤3次后，与相应的荧光第二抗体避光孵育，反应性条带用Odyssey双色红外激光成像仪检测结果。

1.8 数据分析

数据以平均数±标准差(SD)表示,统计比较采用双尾t检验 ,P的显著性用以下标示：*P<0.05;**P<0.01。

2 结果

2.1 洛铂诱导人源膀胱癌5637细胞增殖

通过MTT实验来测定洛铂对人源膀胱癌(5637)细胞的抑制增殖效果。将人源膀胱癌(5637)细胞用浓度为5,10,20,40 μg/ml的洛铂分别处理24,48和72小时。结果如图1所示，洛铂对人源膀胱癌(5637)细胞的增殖具有抑制作用，并呈浓度和时间依赖性。

图1 洛铂对细胞增殖的作用

2.2 洛铂诱导人源膀胱癌5637细胞凋亡

通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒来评估洛铂对人源膀胱癌(5637)细胞的增殖抑制作用是否与细胞凋亡有关。如图2A和2B所示，洛铂处理人源膀胱癌(5637)细胞24小时后，可明显观察到人源膀胱癌(5637)细胞凋亡的显著增加。当洛铂浓度为0 μg/mL时，凋亡率分别为1.5%、11.8%、27.6%、34.4%、45.8%(**P<0.01)。

用Western blot检测5637细胞的凋亡相关蛋白。在洛铂给药24小时后，提取蛋白，检测Caspase-3、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表达。如图2C所示，Caspase-3和Bax蛋白以浓度依赖性的方式增加，而Survivin和Bcl-2蛋白以浓度依赖性的方式降低。

图2 洛铂对细胞凋亡的作用

2.3 洛铂抑制人源膀胱癌5637细胞迁移和侵袭

通过伤口愈合实验和Transwell小室迁移测定实验评估洛铂能否抑制5637细胞迁移和侵袭的能力，如图3A所示，孵育24小时后细胞迁移到伤口区域，从10 μg/ml的洛铂浓度开始，抑制迁移的效果比较明显。如图3B所示，Transwell小室迁移的结果与伤口愈合实验相吻合。通过Transwell小室侵袭实验来评估人源膀胱癌(5637)细胞在不同洛铂浓度时侵入膜屏障的能力。如图3C所示，洛铂处理组侵入的细胞明显减少。

图3 洛铂对细胞迁移和侵袭的影响

3 讨论

有研究表明，化学疗法促进细胞凋亡是杀伤癌细胞的关键机制，肿瘤细胞的敏感性可能影响到化学疗法的效果[11]。因此，在本研究中，我们通过诱导细胞凋亡的方式来证实洛铂抑制癌细胞增殖和降低癌细胞的生存率。MTT法的测定表明，洛铂以剂量依赖性和时间依赖性的方式抑制5637细胞增殖和生长。通过组间两两的对比，可以发现72小时后给药10 μg/ml,20 μg/ml,40 μg/ml的细胞抑制率逐渐趋于平缓，也就是说，当药物抑制率达到一定程度时，增加药物浓度并不能再提高药物的抑制率，反而会导致其他的副作用并降低患者的化疗耐受性。Caspase-3和Bax以浓度依赖性的方式增加，而Survivin和Bcl-2以浓度依赖性的方式降低。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2参与凋亡的内在诱导[12,13]。Caspase-3可通过线粒体依赖性凋亡途径诱导凋亡[14]。抑制细胞凋亡(IAP)蛋白家族的最小成员Survivin参与抑制细胞凋亡的内在和外在途径[15]。因此，线粒体介导的凋亡途径可能部分的证实了洛铂诱导膀胱癌细胞的最后凋亡。

迁移和侵袭是恶性肿瘤的主要特征之一，也是导致患者死亡的根本原因。因此，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭可以有效的防止肿瘤的转移[16]。在本研究中，我们通过体外靶向肿瘤细胞的迁移和侵袭来证明洛铂对膀胱癌的抗转移能力。实验结果表明，用洛铂处理的5637细胞可以有效的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。

综上所述，洛铂能明显的抑制膀胱癌细胞的体外生长，通过与线粒体相关Caspase-3，Bax蛋白上调和Survivin，Bcl-2蛋白下调的途径诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭，为以后的临床研究提供参考依据。

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Inhibitory Effect of Lobaplatin on Cell Proliferation of Bladder Cancer and Possible Mechanism of Inducing Apoptosis

WANGFeng,YUQian,WANGHua.

(DepartmentofPharmacy,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To assess the inhibition effect of lobaplatin on human bladder cancer cells,and reveal the possible mechanisms.Methods Bladder cancer cell line 5637 was routinely cultured in vitro.The cytotoxic effect of lobaplatin was determined by MTT cell proliferation assay;Annexin V-FITC / PI KIT was used to detect the degree of apoptosis by flow cytometry;Wound healing assay was conducted to inspect the migration of cells;Transwell chamber assay was completed to assess the effect of lobaplatin on invasion and migration of the bladder cancer cells;western blot was performed to detect the expression of apoptotic gene.Results Lobaplatin can inhibit human bladder cancer cells and induce apoptosis.In addition,lobaplatin can decrease the expression of Survivin and Bcl-2and increase the expression of Bax and Caspase-3 in the cell line 5637.Conclusion Lobaplatin cytotoxicity can induce apoptosis of bladder cancer cells,which is helpful to in-depth study on the therapy of bladder cancer using lobaplatin.

Lobaplatin;Bladder cancer;Apoptosis;Invasion and migration

吉林省白求恩自然科学基金(20160101032JC)

1007-4287(2016)10-1634-04

R737.14

A

2015-08-28)

*通讯作者