MACC1对宫颈癌细胞侵袭转移能力的影响

黄 莺，吴黎明，张 玲，张 恒，张晶晶，邵建伟，孙庆敏

(1.宜兴人民医院 检验科，江苏 宜兴214211；2.南京医科大学第一附属医院 妇科)



MACC1对宫颈癌细胞侵袭转移能力的影响

黄 莺1，吴黎明1，张 玲1，张 恒1，张晶晶1，邵建伟1，孙庆敏2

(1.宜兴人民医院 检验科，江苏 宜兴214211；2.南京医科大学第一附属医院 妇科)

目的 探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)对宫颈癌细胞Hela侵袭转移能力的影响及机制。方法 Western blot法检测我院10例宫颈癌组织标本和10例癌旁正常组织标本中MACC1的表达，通过脂质体将siRNA-MACC1转入宫颈癌Hela细胞中，MTT法检测细胞活力，Transwell法检测细胞和迁移侵袭能力，Western blot检测基质金属蛋白酶(MMPs)及上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白表达量。结果 宫颈癌组织中的MACC1表达量高于癌旁正常组织(P<0.01)，通过脂质体将siRNA-MACC1及阴性对照转染到宫颈癌Hela细胞后，与对照组比较，siRNA-MACC1组中细胞活力下降，细胞迁移和侵袭能力下降(P<0.01)，MMP2，MMP9及波形蛋白(vimentin)表达量下调(P<0.01)，E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量上调(P<0.01)。结论 MACC1表达下调能抑制宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力，与逆转MMPs，EMT相关蛋白表达有关。

MACC1；宫颈癌；侵袭；转移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1623)

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，但随着宫颈细胞学筛查体系的普及和完善，宫颈癌的发病率明显的上升且趋于年轻化[1]。尽管目前临床上主要采取治疗为主，辅以放疗或生物治疗等多种治疗相结合的方法已显著降低了患者的死亡率，但宫颈癌的侵袭和转移、局部复发仍是绝大多数患者治疗失败的主要原因，是临床上解决的难点[2]。

结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是由Stein等在2009年在结肠癌中发现并命名，定位于人7号染色体上，编码852个氨基酸，并且发现此蛋白与结肠癌转移、预后密切相关[3]。MACC1在多种肿瘤中异常表达，且与癌细胞的侵袭转移密切相关[4-7]。周娜等[4]通过免疫组化检测中-重度宫颈上皮内瘤变组织(CINⅡ-Ⅲ)，91例宫颈癌组织及10例正常宫颈组织，发现MACC1宫颈癌组织、CINⅡ-Ⅲ组织中的阳性表达率分别依次为83.5%、76.5%、80.2%、70.6%，均显箸高于正常宫颈组织，且与组织学分化程度、脉管浸润、肌层浸润深度与宫颈癌盆腔淋巴结转移有关。说明MACC1蛋白高表达是宫颈癌盆腔淋巴结转移的独立危险因素，但具体机制未知，因此本研究通过干扰MACC1基因表达后转染到宫颈癌Hela细胞中，探讨其对细胞侵袭转移能力的影响及机制。

1 材料和方法

1.1 收集2014年6月至2015年6月江苏省宜兴人民医院外科手术切除的宫颈癌组织10例标本及癌旁正常组织10例标本。

1.2 主要试剂和仪器 宫颈癌Hela细胞购自中国科学院细胞库，目录号TCHu187；兔抗MMP2，MMP9，E-cadherin，vimentin单克隆抗体(Epitmics公司)；兔抗MACC1单克隆抗体(Cell Signal Technology)；胎牛血清，DMEM培养基(Hyclone公司)；transwell 小室(Corning 公司)。迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；

1.3 miRNA合成与转染 在上海吉玛制药公司订购合成siRNA-MACC1:上游引物：5’-CACCCUUCGUGGUAAUAAUTT-3’，下游引物：5’-AUUAUUACCACGAAGGGUGTT-3’。阴性对照组上游引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，下游引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。根据细胞培养用品的不同以及上海吉玛公司产品的操作说明推荐siRNA-MACC1与LipofectamineTM2000的比例进行转染。

1.4 MTT法检测细胞活力 将宫颈癌细胞Hela接种于96孔板，当细胞汇合度达到80%时，用LipofectamineTM2000分别转染siRNA-MACC1和阴性对照。48 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT，继续培养4 h，每孔加入150 μl DMSO，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪560 nm处测OD值。1.5 细胞迁移实验 将宫颈癌细胞Hela接种于6孔板当细胞汇合度达到80%时，用LipofectamineTM2000分别转染siRNA-MACC1和阴性对照，转染达到48 h后，将细胞消化加入transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养24 h，取出transwell小室，洗涤，多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置光学显微镜下计数5个视野穿膜细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的迁移能力。

1.6 细胞侵袭实验 将Matrigel胶均匀平铺于transwell 小室的微膜(5 μm)上，制成凝胶备用。其余步骤如1.5所示。计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的侵袭能力。

1.7 Western blot 在收集到的细胞中，加入适量的RIPA裂解液裂解可获得总蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，跑SDS凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育1-2 h。将膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

2 结果

2.1MACC1在宫颈癌组织中的表达Westernblot证实宫颈癌组织中MACC1的表达显著高于癌旁正常组织的表达，其比值分别为(6.32±0.54)vs.(1.48±0.12)(P<0.01)。

2.2MACC1对宫颈癌细胞Hela活力的影响 与对照组比较，siRNA-MACC1组Hela细胞活力下降(P<0.01)。见图1。

与对照组比较，**P<0.01

2.3MACC1对宫颈癌细胞Hela迁移和侵袭能力的影响 如图2，图3所示，通过transwell迁移和侵袭实验发现，与对照组比较，siRNA-MACC1组中Hela细胞迁移和侵袭能力下降。

图2 MACC1对宫颈癌细胞Hela迁移能力的影响

图3 MACC1对宫颈癌细胞Hela侵袭能力的影响

2.4MACC1对宫颈癌细胞Hela中基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响 与对照组比较，siRNA-MACC1组Hela细胞中MMP2，MMP9表达量下降(P<0.01)。见图4。

2.5MACC1对宫颈癌细胞Hela中E-cadherin和vimentin表达的影响 与对照组比较，siRNA-MACC1组中Hela细胞中E-cadherin表达量上升(P<0.01)，vimentin表达量下降(P<0.01)。见图5。

与对照组比较，**P<0.01

与对照组比较，**P<0.01

3 讨论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤中发病率居第二位，仅次于乳腺癌。死亡率已占妇科恶性肿瘤的首位[1]。侵袭转移是导致患者死亡的主要原因[2]。MMP是由结缔组织合成分泌的钙锌依赖性蛋白水解酶家族，几乎能降解除多糖外ECM的所有成分，因此在肿瘤的生长、侵袭转移及血管形成过程中起着重要作用，是促进肿瘤浸润生长的重要因素。MMP2是属于明胶酶类的MMP，主要降解胶原和纤维连接蛋白，在宫颈癌中过表达，并与肿瘤浸润程度及临床分期有关[8]。MMP-9是由多种细胞分泌的一种蛋白水解酶，是MMP中分子量最大的酶，能够降解细胞外基质和基底膜，从而增加细胞的运动能力，促进肿瘤的扩散和转移，在宫颈癌组织中也高表达[9]。上皮来源的肿瘤细胞经历上皮间质转化(EMT)是肿瘤发生转移的第一步，EMT可诱导原发部位的肿瘤播散，侵犯周围组织，通过血液循环或淋巴循环转移至远处形成新的转移灶，在此过程中肿瘤细胞的上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)消失，间质标志物波形蛋白(vimentin)表达增加，肿瘤细胞转移能力加强。江文静等[10]证实E-cadherin的阳性率均与宫颈癌的组织分化、临床分期、有无淋巴结转移以及术后复发有关。魏洁等[11]也发现vimentin的表达与宫颈癌淋巴转移、分化程度密切相关。因此逆转MMPs及EMT相关蛋白的表达，能抑制癌细胞的侵袭转移。

MACC1是2009年Stein应用全基因组表达分析技术在结肠癌原发灶和转移灶中发现的一个新基因，MACC1的表达是预测结肠癌转移形成和无转移生存期的独立影响因素。MACC1在宫颈癌组织中的表达较癌旁正常组织中表达量提高[12]。我们通过Westernblot也证实了宫颈癌组织中MACC1的表达显著高于癌旁正常组织。并且MACC1的表达与多种肿瘤的侵袭转移能力有关。如MACC1通过直接靶向肝细胞生长因子受体c-Met表达从而抑制乳腺癌细胞的侵袭，转移及抗血管生成能力[6]。Pichorner等[13]构建结直肠癌裸鼠移植瘤模型，转染MACC1shRNA后，移植瘤生长速度减弱，转移能力减弱。因此我们通过transwell迁移及侵袭实验证实了当MACC1被下调后，可显著抑制宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力。接着我们通过Westernblot进一步发现MACC1对于Hela细胞侵袭转移能力的抑制作用与上调E-cadherin表达，下调MMP2、MMP9及vimentin表达有关。Zhang等[14]已证实MACC1在乳腺癌组织中过表达，当用siRNA干扰后，可抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭，是通过抑制c-Met及MMP2等蛋白的表达实现的。Zhen等[5]证实MACC1沉默后能通过上调E-cadherin表达，下调MMP9及vimentin表达，从而抑制大肠癌细胞HCT116的迁移、侵袭、转移能力。Gao等[7]也证实MACC1-shRNA转入肝癌细胞Huh7中，能显著下调MMP2、MMP9的表达，从而降低癌细胞的迁移侵袭能力。充分说明了MACC1对于宫颈癌Hela细胞的侵袭、转移能力的抑制作用，与上调E-cadherin、下调MMPs及vimentin表达有关。

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[3]SteinU,BurockS,HerrmannP,etal.CirculatingMACC1transcriptsincolorectalcancerpatientplasmapredictmetastasisandprognosis[J].PLoSOne,2012,7(11):e49249.

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[5]ZhenT,DaiS,LiH,etal.MACC1promotescarcinogenesisofcolorectalcancerviabeta-cateninsignalingpathway[J].Oncotarget,2014,5(11):3756.

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The effect of MACC1 on invasion and metastasis of cervical cancer cell

HUANGYing,WULi-ming,ZHANGLing,etal.

(ClinicalLab,YixingPeopleHospitalinJiangsuProvince,Yixing214211,China)

Objective To explore effect of metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) on invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela.Methods Western blot method was used to detect expression of 10 cases of cervical cancer tissues and normal tissues adjacent to carcinoma.siRNA-MACC1 was transfected into cervical cancer Hela cells by liposome.Cell viability was measured by MTT assay.The ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression matrix metalloproteinase (MMPs) and epithelial mesenchymal transition (EMT) related protein was detected by western blot.Results The expression of MACC1 in cervical cancer tissues was higher than that in normal tissues (P<0.01).After siRNA-MACC1 and negative control were transfected into cervical cancer Hela cells by liposome,compared with control group,cell viability,migration and invasion ability was decreased (P<0.01),the expression of MMP2,MMP9 and vimentin was reduced (P<0.01),the expression of E-cadhetin was increased (P<0.01).Conclusion siRNA-MACC1 could inhibit invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela,which was associated with reversing the expression of MMPs and EMT related proteins.

MACC1;cervical cancer;invasion;metastasis

国家自然科学基金(81001444)

1007-4287(2016)10-1623-04

R737.33

A

黄莺(1983-)，女，硕士，中级检验师，研究方向：生化检验。

2015-10-24)