蒙药组方对大鼠乳腺上皮细胞增殖和分泌及细胞免疫功能的调节

高俊娇，郝羽翀，王英军，史红艳*

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021；2.长春市圣心心脑血管病医院；3.吉林省中医药科学院)



*通讯作者

蒙药组方对大鼠乳腺上皮细胞增殖和分泌及细胞免疫功能的调节

高俊娇1，2，郝羽翀1，王英军3，史红艳1*

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021；2.长春市圣心心脑血管病医院；3.吉林省中医药科学院)

目的 探讨蒙药组方治疗乳腺增生的机制。方法 应用不同浓度蒙药组方刺激体外培养的乳腺上皮细胞，测定乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白mRNA表达；建立大鼠乳腺增生模型，检测不同浓度蒙药组方对大鼠T淋巴细胞亚群的影响。结果 蒙药组方可有效抑制乳腺上皮细胞的增殖，其中0.105 mg/L组在有效抑制乳腺上皮细胞增殖的基础上，对酪蛋白mRNA表达无抑制作用；0.105 g/kg蒙药组方CD4+/CD8+均值高于正常对照组和模型对照组，可以促进机体的细胞免疫功能，能扭转造模过程对机体免疫功能的抑制作用。结论 蒙药组方可有效抑制大鼠乳腺上皮细胞增殖并能促进大鼠细胞免疫功能。

乳腺增生;蒙药组方；细胞免疫

(ChinJLabDiagn,2016,20:1643)

目前，应用传统蒙药组方及其改良组方治疗乳腺增生取得了较好临床疗效。本文力图在细胞水平探讨传统蒙药组方对于乳腺上皮细胞泌乳功能的影响；并以大鼠为动物模型，探讨传统蒙药组方对细胞免疫功能的影响，探究蒙药治疗乳腺增生的机制。

1 材料和方法

1.1 实验药物及对照药物

蒙药组方主要成分包括郁金、王不留行、穿山甲、山慈菇、青皮、牡蛎、山楂、瓜蒌、浙贝母等，由吉林省中医药科学院提供。乳癖消片由沈阳红药制药股份有限公司生产,国药准字Z20003258。他莫昔芬由宁波市天衡制药有限公司生产，国药准字H33021583。

1.2 实验试剂及抗体

改良型RPMI-1640培养基及胎牛血清由Hyclone生产,Dulbecco＇s Modified Eagle Medium(DMEM)购自GIBCO公司,青霉素与链霉素购自华北制药有限公司,表皮生长因子购自英国Pepro-Tech House公司,胰岛素、孕酮、转铁蛋白、谷氨酞胺购自Sigma公司，氢化考的松由天津市生物化学制药厂生产,CCK8试剂盒由东洋纺织生产，细胞总RNA提取试剂盒、Trizol、Reverse Transcriptase、PCR试剂盒、dNTP等购自TAKARA公司，Anti-Rat CD3 FITC、Anti-Rat CD8a PE、Anti-Rat CD4 APC均为eBioscience公司产品，10×氯化铵红细胞裂解液参照文献配制及保存。

1.3 方法

1.3.1 蒙药组方对大鼠乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白mRNA表达的调节 用相差消化和相差贴壁方法,培养和纯化分娩后3-5 d的大鼠乳腺上皮细胞[1-3]。将浓度为1×105/ml乳腺上皮细胞100 μl接种于96孔培养板,48 h后分别加入含不同浓度药物的培养基200 μl，使各组终浓度分别是：他莫昔芬4.200 mg/L、乳癖消1.000 mg/L、蒙药组方0.420 mg/L、蒙药组方0.210 mg/L、蒙药组方0.105 mg/L，每组设三个复孔；1,3和5 d后用CCK8试剂盒及酶标仪测定OD490，并计算细胞相对增长指数。细胞相对增长指数(抑制率)=(试验组OD490-对照组OD490)/对照组OD490×100%。

将密度1×105/ml的乳腺上皮细胞200 μl/孔接种于6孔培养板,48 h后按0.420 mg/L、0.210 mg/L、0.105 mg/L在孔内加入含蒙药组方的培养液，每组设三个复孔，在5%CO2、37℃条件下培养5 d[4]。根据试剂盒操作说明提取各孔细胞总RNA。参照逆转录酶说明书及分子克隆获得细胞总RNA的cDNA。根据Gene Bank中大鼠β-Casien基因(NC_005113)，用PrimerSelect软件筛选引物序列。上游引物为：5’-TTAAAATACACAAAGACACAA-3’；下游引物为：5’-TGCATAACTAGCCAAACATTC-3’。扩增条件如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。

1.3.2 蒙药组方对大鼠T淋巴细胞亚群的影响 雌性大鼠70只，随机分为7组，每组10只，包括正常对照组、模型对照组，他莫西芬4.200 g/kg、乳癖消片1.000 g/kg及蒙药组方0.420 g/kg、0.210 g/kg、0.105 g/kg组。除正常对照组外，其余组别每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg)，连续25天后用黄体酮(4 mg/kg)连续注射5d造成乳腺增生模型[1，4]。造模3w后每天灌胃给药1次，连续4w，正常对照组及模型对照组给予同等体积蒸馏水。末次给药1 h后，用10%水合氯醛麻醉，无菌摘取脾，收集脾淋巴细胞并调整细胞浓度为1×107/ml。用CD3、CD4、CD8抗体标记脾淋巴细胞后在流式细胞仪上检测[5，6]。

2 结果

2.1 蒙药组方对小鼠乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白mRNA表达的影响 见表1。将各组别吸光度值输入SPSS19统计学软件，用单因素AVONA方法分析上述实验数据。作用3 d及5 d后，0.420 g/L蒙药组方组增殖活性值显著低于正常对照组；0.210 g/L和0.105 g/kg蒙药组方5 d组，细胞增殖活性小于对照组。应用蒙药组方5 d后大鼠乳腺上皮细胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR结果见图1。

表1 各试验组别细胞吸光度

与对照组比较*P<0.05,**P<0.001

2.2 实验药物及对照药物对大鼠脾T淋巴细胞亚群的影响

应用SPSS19软件中的单因素AVONA方法分析各实验组和对照组大鼠的脾淋巴细胞亚群分布结果见表2。除0.105 g/kg蒙药组方组外，其他各实验药物组、对照药物组及模型对照组的CD4+T淋巴细胞百分比均低于正常对照组，差异具有统计学意义(表2)。各实验药物及对照药物组的CD8+T细胞百分比与正常对照组及模型对照组比较均无显著性差异(表2)。除0.105 g/kg蒙药组方组外，各实验药物组及对照药物组脾脏T淋巴细胞中CD4+/CD8+的值与正常对照组及模型对照组比较虽无显著性差异，但均值都低于正常对照组；而0.105 g/kg蒙药组方组中的CD4+/CD8+均值高于正常对照组及模型对照组，差异具有统计学意义(表2)。

M：DNA分子量Marker；Lane 1：0.420 mg/L蒙药组方组；Lane 2：0.210 mg/L蒙药组方组；Lane 3：0.105 mg/L蒙药组方组；Lane 4 正常对照组。

图1 应用蒙药组方5 d后大鼠乳腺上皮细胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR结果

3 讨论

不同浓度蒙药组方在作用5 d后对大鼠乳腺上皮细胞均具有抑制作用；0.105 mg/L作用5 d对大鼠乳腺上皮细胞的抑制率最低，并且该组酪蛋白表达量高于0.420 mg/L和0.210 mg/L组。说明在抑制大鼠乳腺上皮细胞增殖的基础上，0.105 mg/L的蒙药组方对乳腺上皮细胞酪蛋白分泌的抑制作用最低。

表2 正常对照组、模型对照组与各药物治疗组脾淋巴细胞亚群的流式细胞分析结果±s，n=3)

与正常对照组比较*P<0.05,#与模型对照组的比较P<0.05

T淋巴细胞亚群对于机体细胞免疫及体液免疫具有重要作用。CD4+T细胞具有调节免疫反应活性、辅助B细胞产生抗体、分泌细胞因子的作用，而CD8+T细胞具有免疫抑制和细胞毒性作用。在正常情况下CD4+/CD8+处于相对稳定状态。CD4+/CD8+下降甚至倒置是细胞免疫功能抑制的表现。在本实验中，模型对照组大鼠脾脏CD4+T细胞比例低于正常对照组，说明模型制备方法对免疫系统具有抑制作用；而各对照药物组和0.420 g/kg蒙药组方组、0.210 g/kg蒙药组方组大鼠的脾脏CD4+T细胞的比例亦低于正常对照组(P<0.05)，说明各浓度的实验药物及对照药物不能扭转造模过程对免疫系统的抑制作用； 0.105 g/kg蒙药组方组大鼠的脾CD4+T细胞比例与正常对照组没有差异(P>0.05)，说明0.105 g/kg蒙药组方对机体的免疫系统无抑制作用；而且该组的CD4+/CD8+均值高于正常对照组和模型对照组，说明0.105 g/kg的蒙药组方可以促进机体的细胞免疫功能，能扭转造模过程对机体免疫功能的抑制作用。

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The Function of Compound Mongolia Medicine on Rat's Cell-Mediated immunity and Regulation to Proliferation and Secretion of Rat's Mammary Gland Epithelium

GAOJun-jiao,HAOYu-chong,WANGYing-jun,etal.

(TheBasicMedicalSchoolofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To study the mechanism of Compound Mongolia Medicine (CMM) on treating mammary gland hyperplasia.Methods Applying different concentration of CMM to stimulate mammary epithelial cells in vitro,the mammary cell proliferation and casein mRNA expression were tested; administrating a series dose of CMM to rat model of mammary gland hyperplasia and detecting the changes of CD4+and CD8+T lymphocyte to evaluate the function of cell-mediated immunity.Results 0.105 mg/L CMM can effectively inhibit the proliferation of breast epithelial cell without inhibiting casein mRNA expression;and 0.105 g/kg CMM can promote the cell-mediated immunity；CD4+/CD8+of 0.105 g/kg CMM group is higher than that of normal control and mammary gland hyperplasia model.Conclusion CMM can effectively inhibit rat mammary epithelial cell proliferation and promote rat cell-mediated immunity.

Hyperplasia of mammary glands;compound Mongolia medicine;cell-mediated immunity

1007-4287(2016)10-1643-03

R655.8

A

2015-10-14)