CD200和CD200R在膀胱和肾脏肿瘤表达的研究

侯睿达，安治国，刘俊婷，毛静涛，孔祥波*，侯治富*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033;2.北京龙迈达斯科技开发有限公司，北京101111)



CD200和CD200R在膀胱和肾脏肿瘤表达的研究

侯睿达1，安治国1，刘俊婷1，毛静涛2，孔祥波1*，侯治富1*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033;2.北京龙迈达斯科技开发有限公司，北京101111)

目的 探索CD200在膀胱、肾脏表达及其在肿瘤微环境的免疫调节作用。方法 应用组织芯片技术，对50例膀胱、肾脏肿瘤组织和癌旁正常组织CD200、CD200R的表达进行对比研究。结果 膀胱癌、肾癌及其癌旁组织CD200和CD200R均呈现不同程度的表达。其中，膀胱癌组织CD200R表达、肾癌组织CD200和CD200R表达显著减低，且以CD200R减低为主。结论 CD200和CD200R在膀胱、肾脏组织表达，且具有一定的组织差异性，提示其在肿瘤微环境免疫调节中具有潜在的价值。

CD200；CD200R；膀胱；肾脏；肿瘤微环境；免疫调节

(ChinJLabDiagn,2016,20:1661)

CD200作为免疫调节分子已经成为当今的研究热点，从最初在髓细胞系表达的发现，到如今被视为肿瘤干细胞，表明了CD200不仅在免疫活性细胞间相互作用，可能在肿瘤细胞与免疫活性细胞间存在肿瘤微环境的调节机制。为了探索CD200和CD200R分子在肿瘤微环境中作用，我们对泌尿系统肿瘤50例临床配对样本进行了筛查，为研究肿瘤微环境免疫调节提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 膀胱、肾脏癌与癌旁正常组织芯片由北京龙迈达斯科技开发有限公司提供，组织芯直径：1.5 mm，切片厚度：3 μm，组织芯数：100芯。其中25对肾癌与癌旁组织，25对膀胱癌与癌旁组织。男性38例，女性12例。18-44岁5例，45-60岁21例，>60岁24例。

1.2 实验方法 CD200抗体、CD200R抗体均为美国Abcam公司产品。将组织芯片切片置于二甲苯中浸泡20分钟脱蜡，换新鲜二甲苯重复一次；将脱腊后的组织切片依次置于100%乙醇中浸泡5分钟×2次，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟再行水化；将柠檬酸-柠檬酸钠抗原修复液微波高火加热至沸腾，放入切片，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加热5分钟，自然冷却至室温；用新配置3%H2O2滴片，室温下避光孵育10分钟；PBS洗5分钟，去除内源性过氧化物酶；用10%正常羊血清，室温封闭10分钟。分别加入1∶50抗CD200、1∶100抗CD200R单克隆抗体，用10%正常羊血清作为实验阴性对照(以PBS稀释)，4℃过夜反应；PBS洗5分钟，共3次；按照Dakocytomation Envision+TM System HRP试剂盒的说明书进行染色；最后用苏木精复染细胞核，中性树胶封片后，光学显微镜下观察并记录结果。

1.3 结果判定 CD200和CD200R表达定位于细胞膜，阳性产物均为黄色或棕黄色颗粒。结果根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定：A：按显色细胞数记分，阳性细胞数<5%为0分，阳性细胞数≥5%-25%为1分，阳性细胞数≥26%-50%为2分，阳性细胞数≥51%-75%为3分，阳性细胞数>75%为4分。B：按细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件，对实验数据分别进行秩和检验和χ2检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 CD200在膀胱肿瘤、肾脏肿瘤的表达

配对膀胱组织芯片和配对肾脏组织芯片的免疫组化结果显示，膀胱癌组织与癌旁组织CD200表达,无论在表达数量或表达强度上，经秩和检验均无显著差异(P>0.05)。而肾癌组织与癌旁组织CD200表达,其表达数量和表达强度，肾癌组织显著低于癌旁组织(P≤0.001)。见图1- 2，表1-4。

2.2 CD200R在膀胱肿瘤、肾脏肿瘤的表达

25例配对膀胱组织芯片(去掉脱落癌旁组织)、25例配对肾脏组织芯片的免疫组化结果显示，膀胱癌组织与癌旁组织CD200表达,其表达数量无显著差异，而表达强度癌组织显著低于癌旁组织(P<0.05)。而肾癌组织与癌旁组织CD200表达,无论在表达数量或表达强度上，肾癌组织显著低于癌旁组织(P<0.001)。见图3- 4，见表5-8。

图1 膀胱癌旁组织(A)与癌组织(B)CD200表达的免疫组化染色(×100)

图2 肾癌旁组织(A)与癌组织(B)CD200表达的免疫组化染色(×100)

01234ZP膀胱癌1421260.3990.690癌旁123532

表2 CD200在膀胱配对样本中的表达强度

表3 CD200在肾脏配对样本中的表达数量

表4 CD200在肾脏配对样本中的表达强度

图3 膀胱癌旁组织(A)与癌组织(B)CD200R表达的免疫组化染色(×100)

图4 肾癌旁组织(A)与癌组织(B)CD200R表达的免疫组化染色(×100)

01234ZP膀胱癌953441.4280.153癌旁43864

表6 CD200R在膀胱配对样本中的表达强度

表7 CD200R在肾脏配对样本中的表达数量

表8 CD200R在肾脏配对样本中的表达强度

3 讨论

CD200和CD200R均为细胞表面糖蛋白，包含两个免疫球蛋白样结构域，属于免疫球蛋白超家族成员。主要通过CD200与CD200R交联传递负向调节功能，在免疫抑制、免疫调节中起着重要作用。CD200主要表达在各种细胞(包括单核细胞、B细胞、T细胞)、胸腺细胞、神经元、内皮细胞等，而CD200R表达比较局限，主要在髓系细胞。目前研究主要集中在造血系统疾病，Gemei等于2013年报道了肿瘤干细胞筛选中CD200在部分肠癌细胞系的表达，提示CD200或CD200R表达的范围可能更加广泛[1-3]。本文研究结果显示，CD200在膀胱的

癌组织和癌旁组织表达率约为40%；肾癌组织的表达率约为35%，癌旁组织约为90%。CD200R在膀胱的癌组织表达率约为64%，癌旁组织约为80%；肾癌组织的表达率约为75%，癌旁组织为100%。在膀胱、肾脏组织表达CD200、CD200R的研究尚未见报道。

研究表明，除了在肠癌细胞系表达CD200外，Borne等的敲出CD200基因动物肢体缺血性实验研究证实，在缺乏CD200-CD200R作用的条件下，缺血局部的淋巴细胞聚集减少、新生血管增加，给予CD200R激动剂可以纠正这一反应[4]，揭示了CD200参与病变局部微环境的调节作用。本研究结果显示，在膀胱上皮组织中，癌与癌旁CD200的表达无显著差异(P>0.05)，癌组织的CD200R表达显著低于癌旁组织(P<0.05)；而肾实质的癌组织CD200和CD200R的表达均显著低于癌旁组织(P≤0.001)。提示CD200和CD200R的表达具有一定的组织特异性，在癌组织中以CD200R表达减少为主(P<0.01)，可能在肿瘤微环境免疫调节中，由于缺乏CD200-CD200R抑制机制，成为成瘤原因之一[5]。同时，其功能是否涉及肿瘤细胞与免疫活性细胞的直接作用等有待进一步研究。

[1]Rozhok AI,De Gregori J.Toward an evolutionary model of cancer:Considering the mechanisms that govern the fate of somatic mutations[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015,112(29):8914.

[2]侯治富，王维忠，印 璞,等.大肠肿瘤基因调控模式初探[J].中国肿瘤临床，1999，26(11)：867.

[3]Gemei M1,Di Noto R,Mirabelli P et al.Cytometric profiling of CD133+ cells in human colon carcinoma cell lines identifies a common core phenotype and cell type-specific mosaics[J].Int J Biol Markers,2013,28(3):267.

[4]van den Borne P,Rygiel TP,Hoogendoorn A,et al.The CD200-CD200 receptor inhibitory axis controls arteriogenesis and local T lymphocyte influx[J].PLoS ONE,2014,9(6):e98820.

[5]Xiong Z,Ampudia-Mesias E,Shaver R et al.Tumor-derived vaccines containing CD200 inhibit immune activation:implications for immunotherapy[J].Immunotherapy,2016,8(9):1059.

CD200 and CD200R expressed in bladder and kidney cancer

HOURui-da,ANZhi-guo,LIUJun-ting,etal.

(China-JapenUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore CD200 expressed in bladder,kidney,and the immunoregulatory effects of tumor microenvironment.Methods The expression of CD200 and CD200R were detected in 50 cases of bladder,renal tumor tissue and adjacent tissue by tissue microarray technology.Results The expression of CD200 and CD200R in bladder,kidney,and adjacent tissue of carcinoma present different level.The expressions of CD200R in bladder,and both CD200 and CD200R expression in kidney tissue significantly reduced,especially with CD200R decreases.Conclusion CD200 and CD200R expressed in bladder,kidney were found,and which presents certain difference.The results suggest that CD200 and CD200R are the potential elements of prompting the immune regulation in tumor microenvironment.

CD200;CD200R;bladder;kidney;tumor microenvironment;immune regulation

吉林省基因工程药物工程实验室建设项目(吉发改高技【2011】1084号)

1007-4287(2016)10-1661-03

R737.11 R737.13

A

2015-03-27)

*通讯作者