乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析

邹淑慧，肖九长，张丽琴，唐金凤，刘奕红

（赣州市人民医院检验科，江西赣州341000）

乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析

邹淑慧，肖九长，张丽琴，唐金凤，刘奕红

（赣州市人民医院检验科，江西赣州341000）

目的初步调查乙型肝炎病毒（HBV）特异性CTL表位的序列特点，同时探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法本研究采用PCR扩增法获取HBV全基因并测序，参考国外文献报道的17个热点HBV特异性CTL表位氨基酸序列，分析其与本文获得的CTL表位氨基酸序列的差别。对患者各个表位变异的差异进行卡方检验。结果获得46份HBV全基因组序列，急性乙型肝炎（AHB）15例，慢性乙型肝炎（CHB）18例，慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。其中40份属于B基因型，6份属于C基因型。对17个表位进行分析发现，B基因型中变异较大的表位有S183-191，S382-390，C18-27，X36-44，X52-60和X115-123；C基因型中有P816-824，C18-27，X36-44，X52-60和X115-123。P816-824表位在CHB和CSHB组的变异率为27.8%和46.2%，显著高于AHB组（0%，P＜0.01）；C23-31表位在CHB组的变异率为22.2%，显著高于AHB和CSHB组（0%，0%，P＜0.05）。结论了解HBV CTL表位序列特点，分析其与文献报道的CTL表位的差异情况，对防治乙型肝炎的重症化和慢性化具有指导意义。

乙型肝炎病毒；CTL表位；变异

乙型肝炎病毒感染以后可表现为急性乙型肝炎（Acute hepatitis B，AHB）、慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）、慢性重型乙型肝炎（Chronic severe hepatitis B，CSHB）、肝硬化（Liver cirrhosis，LC）甚至是肝癌等多种疾病谱［1］。HBV感染主要是由机体免疫反应引起的肝细胞病变。HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte，CTL）识别主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）I类分子以及细胞内合成的病毒蛋白肽复合物，抗原递呈细胞将其递呈给免疫淋巴细胞，使HBV感染细胞凋亡［2，3］。研究发现HBV特异性CTL抗原表位的变异会导致CTL无法识别HBV，病毒难以清除而导致HBV感染慢性化［4，5］。明确HBV特异性CTL主要的识别表位有助于HBV的清除。本研究将对AHB、CHB和CSHB患者中的HBV特异性CTL表位特点进行分析，并探讨其对病情发展和预后的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料乙肝病毒六项HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb，PreS诊断试剂盒（中山生物工程有限公司），DNA提取液（中山大学达安基因股份有限公司），TransTaq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）试剂盒及DNA Marker由北京Transgen生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病例来源和DNA分离研究对象：选取2015年1月-2015年6月期间在江西省赣州市人民医院就诊的慢性乙型肝炎患者。其中AHB组男12例，女3例，平均（46.06±13.37）岁；CHB组男13例，女5例，平均（52.37±12.07）岁；CSHB组男12例，女1例，平均（57.95±10.10）岁。诊断均符合2000年版《病毒性肝炎防治方案》［6］。采集患者静脉血，分离血清50μl加入50μl DNA提取液，振荡5s，100℃恒温10min，12000r·min-1离心5min，上清备用。

1.2.2 PCR扩增目的片段分段PCR扩增及测序引物：AF1：5'-tcc agg atc atc aac aac cag-3'；AR1：5'-gcc tac agc ctc cta gta caa ag-3'；F3：5'-cat gga gac cac cgt gaa cgc-3'；R3：5'-tgt cct tgt gcg ggt tga-3'；F4：5'-cca cac gta gcg cct cat-3'；AR4：5'-ca tcc ata taa ctg aaa gcc-3'，由上海invitrogen生物科技有限公司合成。PCR产物交上海Invitrogen生物科技有限公司测序。反应参数如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃再延伸10min。

1.2.3 目的基因测序将20μl PCR扩增产物及测序引物2μl/对，委托Invitrogen生物科技有限公司进行DNA测序。

1.2.4 HBV基因分型从GenBank获得十种基因型HBV S基因序列（A-HE576989、B-AB675676、C-GQ377601、D-AB090268、E-HM363565、F-DQ7 76247、G-GU565217、H-HM117851、I-AF241409、J-AB486012），运用Clustal X和Mega 4软件对十种基因型以及所测定的HBV S基因序列进行比对，用Kimura2参数法推算进化距离，Neighborjoining法构建进化树，分型的依据为标本与十种基因型序列在进化树中所处的遗传进化关系，以此判定HBV的基因型。

1.2.5 序列分析选择文献报道中的17个HBV特异性CTL表位，包括HLA-A2限制性表面抗原表位5个、多聚酶抗原表位2个、核心抗原表位3个、X蛋白表位6个以及HLA-A11限制性C蛋白表位1个作为参考序列，用VectorNTI软件对测定基因序列的推导氨基酸序列与报道的CTL表位段肽序列进行比较。

1.2.5 统计学分析应用SPSS 13.0软件对三组患者间各表位变异的差异进行卡方检验，P＜0.01为具有非常显著性差异，P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 PCR测序结果及HBV基因型的判定成功获得46份完整的基因序列，将获得的全基因序列与已知的十种基因型S基因序列构建进化树，结果发现40份标本属于B基因型，6份属于C基因型。（图1）

图1 HBV S基因遗传系统进化树

2.2 CTL表位序列变异差异分析与文献报道的17个CTL表位序列相比，本文获取的HBV序列检出了不同程度的变异，B型和C型HBV基因型对一些表位的变异有明显影响（表1）。17个CTL表位中有15个表位发生变异，3个表位没有变异。X区变异较大，尤其是X36-44（TLPSPSSSA），X52-60（HLSLRGLFV），X115-123（CLFKDWEEL）表位变异率最高，最高达100%。有的表位B型和C型HBV间变异发生率有明显不同，如表位S183-191（FLLTRILTI）变异率在B型和C型中分别为100%（40/40）和16.6%（1/6）；表位S382-390（ILSPFLPLL）变异率则分别为95%（38/40）和33.3%（2/6）；而表位P816-824（SLYADSPSV）变异率分别为15%（6/ 40）和83.3%（5/6）。有些表位变异率很低甚至未发生变异，如S335-343（WLSLLVPFV）、A2：C117-125（EYLVSFGVW）变异率均为0。有的变异表位发生多个氨基酸替换，如表位S382-390，C18-27，X36-44，X102-110和X115-123等；有的表位只有一个氨基酸发生改变，如表位S183-191，P575-583H和C88-96等。同一变异位点的替换氨基酸多为同一种氨基酸，但也有不同的变异种类，如表位X15-23 VLCLRPVGA可变异为VLCLRPVCA或VLCLRPVSA。对AHB、CHB和CSHB三组患者间进行比较时，发现P816-824表位在CHB和CSHB组的变异率为27.8%和46.2%，显著高于AHB组（0%，P＜0.01）；C23-31表位在CHB组的变异率为22.2%，显著高于AHB和CSHB组（0%，0%，P＜0.05）（见表2）。

3 讨论

乙型肝炎病毒目前分为A-J 10种基因型，B型和C型为我国主要流行的基因型，基因型对HBV感染的发病程度有一定影响［7-9］。

HBV特异性CTL应答是宿主有效清除肝细胞内HBV的关键因素。CTL表位是引起免疫应答和免疫反应的基本单位，决定CTL特异性杀伤效应，在免疫识别和免疫激活中发挥重要作用。在免疫和抗病毒治疗的压力下，HBV病毒可发生变异，包括逃逸性表位的变异。病毒的CTL表位变异可能是HBV逃避免疫应答，引起乙型肝炎慢性化的重要机制［10-12］。

HBV感染的机制较复杂，所感染的HBV基因组变异是主要原因之一。本研究采用PCR技术对乙肝患者血清标本进行DNA扩增并测序，获得46份完整的基因组序列。急性乙型肝炎（AHB）15例，慢性乙型肝炎（CHB）18例，慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。以国外文献报道中的17个HBV特异性CTL表位为参考序列，用VectorNTI软件对测定基因序列的推导氨基酸序列与其进行比较。结果发现，17个CTL表位中有15个表位发生变异，3个表位没有变异。其中X区变异较大，尤其是X36-44（TLPSPSSSA），X52-60（HLSLRGLFV），X115-123（CLFKDWEEL）表位变异率最高，最高达100%。然而这些表位在AHB、CHB及CSHB三组患者间并无统计学差异。提示国内乙肝患者的某些CTL表位与国外报道的可能存在不同，进行疫苗设计和免疫治疗时应做相应的调整。基因型HBV CTL表位的变异发生率存在有明显不同，如S区表位S183-191（FLLTRILTI）和S382-390（ILSPFLPLL）在B基因型患者中的变异率较C基因型更高。报道称HBV S区表位的变异可诱发CTL特异性免疫反应引起疾病慢性化［13］。HBV C区表位18～27是国内外学者研究中常用的表位，其变异与慢性乙型肝炎及肝纤维化的发生相关［14］。然而在本研究中发现C18-27（FLPSDFFPSV）的变异在三组患者间的变异率都是100%，无统计学意义。这可能与国内外流行的HBV病毒株不同有关，其特异性CTL表位在大多数位点上都出现变异，且差异较大，导致研究结果不尽相同。对AHB、CHB和CSHB三组患者间进行比较，发现P816-824表位变异率在CHB组（27.8%）和CSHB组（46.2%）中显著高于AHB组（0%）（P＜0.01），提示该位点的变异与可能会引起肝内炎症活动，加快疾病进程。C23-31表位在CHB组中的变异较高，P＜0.05，提示C23-31变异与慢性乙型肝炎有关。值得注意的是三组患者中有的表位变异率增高，有的降低，说明各表位在HBV诱导的机体CTL免疫应答中所起的作用不同。文献报道和我们的研究发现不同患者对各HBV抗原表位的CTL频率以及反应并不一致。

表1 B型和C型HBV特异性CTL表位序列变异位点差异

表2 AHB、CHB和CSHB患者间HBV特异性CTL表位序列变异发生频数比较

HBV感染过程中，宿主免疫反应程度与HBV感染后肝纤维化及肝癌发生有密切关系［15］。不同患者对HBV抗原表位的CTL频率和反应强度也不尽相同。国内乙肝患者的某些CTL表位与国外报道的存在一定差异，因此在进行特异性细胞免疫反应研究时，不能简单套用国外鉴定的表位序列。研究CTL特异性表位的突变情况可为疾病的早期预防、干预、疫苗设计及个性化治疗提供科学依据。

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Analysis of variation in CTL epitope of Hepatitis B Virus

ZOU Shuhui，XIAO Jiuchang，ZHANG Liqin，TANG Jinfeng，LIUYihong.
Department of Laboratory Medicine，Ganzhou People's Hospital of Jiangxi Province，Ganzhou Jiangxi 341000，China.

Objective To investigate the characteristics of CTL epitope of hepatitis B virus and explore the possible mechanisms of severity and chronicity of hepatitis B.Methods Serum samples were collected from patients infected with hepatitis B virus（HBV），PCR method was used to amplify the whole gene of HBV DNA and the PCR products were sent to be sequenced directly.Amino acid sequences of 17 cytotoxic T Lymphocyte（CTL）epitopes previously reported abroad were taken as

equences，and comparison was made between these reference sequences and CTL epitopic sequences obtained from patients with chronic hepatitis B.The difference was calculated by χ2test.Result Complete HBV genome of 46 samples was successfully amplified and sequenced.15 patients with acute（AHB），18 chronic（CHB）and 13 chronic severe hepatitis B（CSHB）.40 of which belongs to genotype B，while 6 belongs to genotype C.In the 17 analyzed CTL epitopes，S183-19，S382-390，C18-27，X36-44，X52-60 and X115-123 varies greatly in genotype B，while P816-824，C18-27，X36-44，X52-60 and X115-123 in genotype C.The mutation rates at P816-824 were higher in patients with CHB（27.8%）and CSHB（46.2%）than that in AHB（0%，P＜0.01），C23-31 was also higher in patients with CHB（22.2%）than that in AHB and CSHB（0%，0%，P＜0.01）.Conclusion To investigate the characteristics of hepatitis B virus CTL epitopes in infected people and analyze the mutations will aid in treatment and prevention of severity and chronicity of hepatitis B.

Hepatitis B virus；CTL epitopes；Mutation

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129（2016）05-0591-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.017

2016-04-11；

2016-08-30）

邹淑慧，女，1988年11月生，硕士学位，检验技师，医学检验专业，研究方向为病原生物学。E-mail：364235529@qq.com通信作者：张丽琴，女，1981年9月生，学士学位，副主任技师，医学检验专业，研究方向为微生物学及分子生物学。E-mail：13970781829@163.com