江西地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析

孔蕴源，吕小林，江 梅，聂益军，张长林，万腊根

（南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006）

江西地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析

孔蕴源，吕小林，江 梅，聂益军，张长林，万腊根

（南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006）

目的探讨江西地区非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变类型、突变率及其与临床特征的关系。方法收集2014年3月至2015年6月南昌大学第一附属医院非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织78例，采用等位基因特异性扩增-聚合酶链反应（ARMS-PCR）方法，对非小细胞肺癌患者肿瘤组织EGFR基因18～21外显子突变进行检测，并分析其突变类型、突变发生率及其与临床特征之间的关系。结果在78例非小细胞肺癌患者中，共有27例发生EGFR基因突变，总突变率为34.6%。其中，第18、19、20、21号外显子突变率分别2.6%（2/78），12.8%（10/78），3.9%（3/78），14.1%（11/78）。一例既有21号外显子突变，又有20号外显子突变，其中，19号外显子的突变均为第746～750密码子的碱基缺失，21号外显子突变类型以L858R为主，且19号外显子的突变率与21号外显子的突变率无统计学差异（P＞0.05），女性EGFR基因的突变率显著高于男性，不吸烟者显著高于吸烟者，腺癌患者显著高于鳞癌患者（P＜0.05），而EGFR基因的突变率与非小细胞肺癌患者的年龄、临床分期无相关性（P＞0.05）。结论江西地区的非小细胞肺癌EGFR基因突变以19、21号外显子为主，常见于女性、不吸烟、腺癌的非小细胞肺癌患者。

非小细胞肺癌；表皮生长因子受体基因；基因突变

肺癌是病死率最高的恶性肿瘤。肺癌中非小细胞癌约占80%～85%［1］。尽管手术和放化疗技术不断提高，但非小细胞肺癌患者的生存率仍然较低。随着肿瘤生物学的发展，靶向药物的出现，为肺癌患者提供了一个新的治疗方法。有研究表明［2］以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）在化疗耐药的非小细胞肺癌治疗中显示了良好的效果。且EGFR-TKI结构域的前4个外显子（外显子18～21）发生突变的患者对靶向药物的反应性更好［3-5］。根据EGFR基因突变的数据分析，虽然突变位点分散在外显子18～21上，但89%的突变集中在第19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变［6］。国外已有相关报道发现EGFR突变在女性非吸烟患者中的发生率较高；不同年龄的肺癌患者EGFR突变率无明显差异［7，8］，中国不同地区EGFR基因突变存在显著的地域差异，台湾［9］和四川［10］地区的EGFR基因的突变以外显子21为主，云南［11］和广东［12］地区、湖南［13］地区以外显子19为主，而北京［14］、上海［15］和新疆［16］地区、西南［17］地区、广西南宁［18］地区19号外显子和21外显子突变率无明显差异，本文章旨探讨江西地区非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变类型、突变率及其与临床特征间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取2014年3月-2015年6月在南昌大学第一附属医院就诊的非小细胞肺癌患者共78例，其中男性43例，女性35例，年龄37岁～81岁，中位年龄61岁，所有肿瘤组织均为石蜡包埋组织，经切片后，苏木素-伊红（HE）染色，由两位病理医师诊断为非小细胞肺癌，其中，腺癌62例，鳞癌16例，Ⅰ/Ⅱa期30例，Ⅱb/Ⅲ/Ⅳ期48例。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取采用罗氏公司的cobas？DNA样品制备试剂盒，按试剂盒说明书操作提取基因组DNA，用Q-3000超微量分光光度计（Quawell公司产品）测定DNA纯度及含量，要求A 280/A260＞1.80，将DNA样品稀释成浓度为2ng/μL的稀释样本作为模板上机检测。

1.2.2 实时荧光定量PCR扩增采用扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）扩增EGFR基因18、19、20及21外显子。采用罗氏公司的cobasEGFR突变检测试剂盒和cobas z 480分析仪对EGFR基因18～21号外显子41种突变进行PCR扩增检测，所有操作按试剂盒说明书进行。为了确定运行的有效性，每一次反应中均包括一个突变对照和阴性对照。扩增条件和参数均为保密设置，仪器自动化给出突变检测结果。

1.2.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变情况在78例非小细胞肺癌患者中，共有27例发生EGFR基因突变，总突变率为34.6%。其中，第18、19、20、21号外显子突变率分别2.6%（2/78），12.8%（10/78），3.9%（3/78），14.1%（11/78），1例既有21号外显子突变，又有20号外显子突变，其中，19号外显子的突变均为第746～750密码子的碱基缺失，21号外显子突变类型以L858R为主，且19号外显子的突变率与21号外显子的突变率无统计学差异（P＞0.05）。此外，还可见到18号外显子G719X突变20号外显子突变发现3例，其中，2例为插入突变，1例为T790M突变，1例既有21号外显子L858R突变，又有20号外显子T790M突变（见表1）。

表1 78例肺癌患者EGFR基因突变率和突变类型分析

2.2 EGFR基因突变与临床特征的关系女性EGFR基因的突变率48.6%（17/35）显著高于男性23.3%（10/43）（χ2=5.464，P=0.019），不吸烟者的EGFR基因突变率45%（18/40）显著高于吸烟者23.7 %（9/38）（χ2=3.912，P=0.048），腺癌患者EGFR基因突变率40.3%（25/62）显著高于鳞癌患者12.5%（2/16）（χ2=4.35，P=0.037），而年龄≤60岁的患者EGFR基因突变率38.9%（14/36）与年龄＞60岁的患者EGFR基因突变率31%（13/42）无统计学差异（χ2=0.539，P=0.463），临床分期为I+IIa期的患者EGFR基因突变率36.7%（11/30）与IIb+III+IV期的患者EGFR基因突变率33.3%（16/48）无统计学差异（χ2=0.091，P=0.763），故本研究结果提示江西地区EGFR基因的突变与非小细胞肺癌患者的性别、吸烟与否、病理类型相关，而与年龄、临床分期无相关性（见表2）。

3 讨论

EGFR基因属于酪氨酸激酶受体家族，其定位于七号染色体短臂上（7p12），长约118kb，由28个外显子组成，EGFR基因突变覆盖在编码酪氨酸激酶区的第18～21外显子上，但突变集中在19外显子的缺失和2l外显子的L858R点突变上［6］，且在亚洲人中，非小细胞肺癌患者EGFR的基因突变率为30%［19，20］。本研究中突变也主要集中在l9外显子的缺失和2l外显子的L858R点突变上，其它外显子突变率不高，EGFR基因总突变率为34.6%，略高于亚洲人群的平均突变率。19号外显子的突变均为第746～750密码子的碱基缺失，21号外显子突变类型以L858R为主，且19号外显子和21号外显子突变率无明显统计学差异（P＞0.05）。这与北京［14］、上海［15］和新疆［16］、西南［17］、广西南宁［18］等地区报道一致。本研究检测到20外显子突变3例，其中2例为插入突变，一例为T790M突变，文献报道这两种突变均与发生EGFR-TKI获得性耐药相关［21，22］，EGFR 20外显子T790M突变被认为是NSCLC患者发生EGFR-TKI获得性耐药的主要原因。体外实验发现［23］，EGFR-TKI对T790M突变型细胞的有效抑制浓度超过5μmol/L，这个浓度是EGFR 19外显子缺失突变或21外显子L858R突变细胞的100倍以上。可见，含有T790M突变的细胞常是耐药细胞。本研究中发现一例患者既有21号外显子突变，又有20号外显子突变。这种现象一般见于接受TKI治疗患者发生耐药后的肿瘤组织标本中，在未用靶向药物的患者中少见。此结果提示该患者可能同时伴有两种原发性肿瘤细胞或肿瘤细胞亚群，初期对EGFR-TKI敏感，同时不发生原发耐药，经过TKI的反复作用又容易产生耐药。该患者现阶段正在进行TKI治疗，我们将继续追踪该患者的预后和转归。

表2 78例肺癌患者EGFR基因突变与临床特征的关系

国外已有相关报道发现EGFR突变在女性非吸烟患者中的发生率较高，不同年龄的肺癌患者EGFR突变率无明显差异［7，8］，中国不同地区EGFR基因突变存在显著的地域差异［9-18］，本研究发现，江西地区女性患者EGFR基因的突变率显著高于男性（χ2=5.464，P=0.019），不吸烟者的EGFR基因突变率显著高于吸烟者（χ2=3.912，P=0.048），腺癌患者EGFR基因突变率显著高于鳞癌患者（χ2=4.35，P=0.037），而年龄≤60岁的患者EGFR基因突变率与年龄＞60岁的患者EGFR基因突变率无统计学差异，临床分期为I+IIa期的患者EGFR基因突变率与IIb+III+IV期的患者EGFR基因突变率无统计学差异（χ2=0.091，P=0.763），故本研究结果提示江西地区EGFR基因的突变与非小细胞肺癌患者的性别、吸烟与否、病理类型相关，而与年龄、临床分期无相关性，这基本与国内报道一致。

综上，江西地区非小细胞肺癌患者的EGFR基因突变主要见于女性、不吸烟以及腺癌患者。目前，已报道的检测EGFR基因突变的方法很多，主要包括直接测序法、探针扩增阻滞突变系统（ARMS）、Taqman探针荧光定量PCR法、高分辨率熔解曲线分析法（HRM）、PCR-荧光探针杂交技术、单链构象多态性分析法（SSCP）、高效液相色谱法（DHPLC）等。这些方法的检测成本及检测性能各异，如直接测序法灵敏度较低，突变基因比例低于总基因拷贝数的20%时难以检出结果，容易漏诊，而SSCP耗时费力、结果判读较复杂等，本实验所使用的是探针扩增阻滞突变系统（ARMS）法，该法灵敏度较高，能可靠地检出FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，福尔马林固定石蜡包埋）样本中≥5%的突变水平，且一次检测能覆盖41种突变，但不足之处是，有些外显子只能检测到突变，但不能检出具体的突变位点和突变类型，此时需要结合基因测序法才能确定，我们可以根据临床的实际需求选择是否结合基因测序，使结果更加适应临床的需要。通过EGFR基因突变检测筛选出受益人群，最佳地发挥EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物的分子靶向疗效。

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Analysis of EGFR mutations in non-small cell lung cancer in Jiangxi KONG

Yunyuan，LV Xiaolin，JIANG Mei，et al.
Depart-ment of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigete mutations types and mutation rate of the epidermal growth factor receptor gene（EGFR）in the non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and clinical features of the NSCLC within EGFR gene mutation in Jiangxi Province.Methods Paraffin-embedded tissue samples of the NSCLC patients were collected in the First Affiliated Hospital of Nanchang University from March 2014 to June 2015，the mutation in the exon 18-21 of EGFR gene were detected by Allele specific amplification polymerase chain reaction（ARMS-PCR）method.The relationship between the mutation types，the incidence of the mutation and the clinical features were analyzed.Results In the 78 NSCLC patients，there were 27 patients with mutation of the EGFR gene.The total mutation rate of EGFR in NSCLC was 34.6%，which were detected in the exon 18（2.6%，2/78），the exon 19（12.8%，10/78），the exon 20（3.9%，3/78）and the exon 21（14.1%，11/78）.Intriguingly，there was a case with two mutations in exon 20 and 21 respectively.The mutations of EGFR in exon 19 were all resulted in the deletions of codons 746 to 750.The main mutation type in exon 21 was L858R.There was no significant difference in the exon 19 mutation rate and exon 21 mutation rate（P＞0.05）.The mutation rate in female patients of EGFR gene was significantly higher than in male ones，and higher in non-smoking patients than in smoking ones（P＜0.05）.The mutation rate of EGFR gene in adenocarcinoma patients was significantly higher than squamous cell carcinomas（P＜0.05），but had no correlation with the age and clinical stage of patients with NSCLC（P＞0.05）. Conclusion Mutation frequency of EGFR in NSCLC patients in Jiangxi province were more frequently detected in female，nonsmoking and adenocarcinoma patients，and the main types of mutation were exon 19 and exon 21.

NSCLC；EGFR；Gene mutation

R734.2

A

1674-1129（2016）05-0557-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.006

2016-08-11；

2016-10-11）

南昌大学校级青年基金（编号：xjjyk09018）

孔蕴源，男，1983年8月出生，硕士，主管技师，从事临床血液学诊断，主要研究白血病及肿瘤的分子机制

江梅，女，1986年10月出生，硕士，主治医师，从事临床血液学诊断，主要研究白血病及肿瘤的分子机制