两株猪流行性腹泻野毒的确证及N基因的分析

莫炜钰，罗　均，莫梅君，赵　静，张　琼，朱盛和，陈　昊，林颖仪，郭霄峰

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

两株猪流行性腹泻野毒的确证及N基因的分析

莫炜钰，罗均，莫梅君，赵静，张琼，朱盛和，陈昊，林颖仪，郭霄峰

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

将发病猪场仔猪小肠内容物病料经胰酶处理后接种Vero细胞，经观察CPE和特异性RT-PCR确认分离得到两株PEDV野毒株，并命名“CH/GDZH01/1311”（简称“ZH01”）、“CH/GDZH02/1401”（简称“ZH02”）。经扩增和测定N基因，分析得知它们属于G2-1亚群流行毒株。将ZH01和ZH02及其中连续传代的ZH02-f57毒株进行3日龄仔猪的回归试验，发现它们均有100%致死率，但ZH02-f57毒株引起的发病症状相对迟缓。该研究为PED变异毒株的弱毒疫苗研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒；分离鉴定；N基因；进化分析；致病性

猪流行性腹泻（PED）主要发生于10日龄内的仔猪，临床症状为呕吐、腹泻及脱水，死亡率高达100%。该病最早于1971报道英国和比利时的养猪场［1］。我国于2010年底大规模暴发PED，且近年来一直未得到有效控制，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。当2013年4月在美洲国家首次暴发，及后来在亚洲和欧洲部分国家再次暴发PED疫情，使该病再次在世界范围内给养猪业带来了巨大的危害［2-3］。PEDV为有囊膜，核酸为单股正链不分节段的RNA病毒，属于α-冠状病毒属的成员。在病毒侵染的细胞中N蛋白的含量比较多，可作为早期诊断［4］。ORF3作为PEDV基因组中的惟一辅助基因，与病毒毒力有关［5］。同时，我国境内病毒性腹泻主要为PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRV），而以PEDV的危害为最大［6］。

1　材料

1.1病料2013年底及2014年初从华南地区猪场采集仔猪肠段组织病料。

1.2病毒及细胞TGEV、PEDV二联活疫苗，购自哈尔滨维科生物技术开发公司。TGEV、PRV和Vero细胞由华南农业大学兽医微生物实验室保存。

1.3试剂RNA提取试剂盒，购自Magen公司；高保真酶PrimerSTAR Max，载体pMD18-T，购自TaKaRa公司；DMEM培养基和胰酶，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自BI公司。

1.4仔猪12头未吃初乳新生仔猪，购自华南地区某种猪场。

2　方法

2.1病料处理阳性病料经研磨，冻融，离心后用0.22 μm滤膜过滤，冻存于-80℃。

2.2引物设计 参考GenBank公布的PEDV序列，以Primer 6.0软件设计N基因引物，上游引物：5′-ATTCAGCTGTGAGTAATCCGA-3′，下游引物：5′-ACCGTTGTGTGCAAGACCAA-3′，扩增片段大小1 542 bp。参照张坤［9］的报道设计PEDV、TGEV、PRV三重RT-PCR检测引物。参考Park，S.J［10］的研究设计PEDV野毒株和疫苗株二重RT-PCR鉴别诊断引物。

2.3PEDV的培养及鉴定Vero细胞经PBS洗涤3次，加入含有胰酶的细胞培养液和1.1方法得到的病料滤液，孵育1.5 h后弃液，并添加新培养液。37℃培养4 d，收集培养物，-80℃冻融3次。以三重检测引物对培养物中的病毒进行鉴定。

2.4病毒滴度测定96孔培养板单层Vero细胞经PBS洗涤3次，加入待测病毒及含胰酶的培养液，37℃培养4～5 d，按Reed-Muech氏法计算病毒的滴度。

2.5ORF3基因检测参照Park，S.J［10］二重RTPCR方法进行ORF3基因完整性检测。

2.6N基因克隆及序列分析高保真酶扩增N基因，经连接转化，挑取若干单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序。使用Lasergene 7.10软件进行序列拼接及同源性分析。运用MEGA 6.06构建遗传进化树。

2.7动物回归试验未吃初乳的新生仔猪，试验前先隔离观察2 d，并以三重RT-PCR检测仔猪直肠拭子。攻毒方法为先口服1 mL病毒液（1×105.0TCID50/mL），再口服5 mL DMEM饮漱，Mock组2头仔猪口服6 mL DMEM。攻毒后，每天喂食时观察记录。攻毒后死亡仔猪经剖检记录，并取肠段内容物进行PEDV、TGEV、PRV检测。

3　结果

3.1病毒的分离及滴度测定18份病料在Vero细胞中经过4～5代次连续盲传，其中2份可以引起细胞产生明显的CPE（图1）。病毒适应细胞后，按Reed-Muech氏法测定ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57滴度分别为1×105.50，1×106.25，1×106.75TCID50/mL。

图1　PEDV在Vero细胞中的病变

3.2病毒的鉴定以三重RT-PCR引物对ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57进行扩增。结果显示，扩增产物中只能获得663 bp的DNA片段，表明病毒分离物中只含有PEDV。

3.3野毒与疫苗毒鉴定以二重RT-PCR引物对ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57和PEDV商品化弱毒毒株CV777进行扩增。结果显示，ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57的扩增片段为245 bp，弱毒CV777的扩增片段为194 bp，表明它们均为野毒株。

3.4N基因扩增及测序以ZH01-f0、ZH02-f0为模板进行N基因扩增。结果显示，两株分离病毒均扩增出片段约为1 550 bp的片段，与理论值大小相符。

将N基因测序得知，ZH01与ZH02毒株相互间核苷酸同源性为98.7%，氨基酸同源性为99.5%。存在17核苷酸的差异及4个氨基酸的不同，由此认为它们是不同的毒株。在参考序列中，构建的遗传进化树显示PEDV可分为4个亚群，两个新分离毒株分布在近年较活跃的流行毒株区域，均属于G2-1亚群。从参考毒株中选择2010年开始得到的毒株作为流行株比较，两个新分离毒株与我国流行毒株的核苷酸同源性为99.8%～94.6%同源性，与经典G1亚群的CV777毒株核苷酸同源性只有95.7%和95.6%。而ZH01毒株与2012年江苏、杭州JS-HZ2012毒株同源性最高，为99.6%，ZH02毒株与2014年德国GERL00721-2014同源性最高，为99.9%（图2）。

图2　PEDV N基因系统发育树分析

3.5动物回归试验

3.5.1仔猪外源病源检测攻毒前对仔猪混合粪便样品进行三重RT-PCR检测。结果显示，所有仔猪均未感染PEDV、TGEV和PRV。

3.5.2仔猪临床发病特征及剖检病变仔猪在攻毒前健康状况良好。按2.7法攻毒后，有的弱仔猪呈急性发病。其他攻毒仔猪出现呕吐、腹泻和脱水症状。随着病情加重，精神沉郁，食欲下降但不废绝，排便腥臭。发病后期边吃边拉，严重脱水，消瘦，共济失调，排便失禁，肛门红肿。最后脱水衰竭而死亡。Mock组未见呕吐及腹泻症状。对病死仔猪进行剖检，眼观可见仔猪胃部膨大胀气，有未完全消化的凝乳，偶见消化物起泡沫，胃黏膜容易脱落。肠道变脆变薄，严重充血出血，内容物呈水样。

3.5.3攻毒后仔猪检测攻毒后对Mock组仔猪取直肠拭子而对每只死亡仔猪的小肠段内容物进行三重RT-PCR检测。结果显示，所有攻毒仔猪均只感染PEDV，而Mock组仔猪无感染。

3.5.4数据统计攻毒后，ZH01-f7和ZH02-f6可引起3日龄仔猪12 h～16 h内出现呕吐症状，16 h后出现剧烈腹泻并出现死亡病例；而经过57次传代的ZH02-f57攻毒组在27 h时才出现呕吐，37 h时才出现又拉又吐症状。最终所有攻毒仔猪最终在84 h后死亡，均表现100%死亡率（图3），而Mock组仔猪没有出现呕吐和拉稀症状。

图3　仔猪发病后死亡时间

4　讨论

在2010年底暴发的全国性PED疫情表明，目前经典商品疫苗对流行野毒株的保护力并不完全有效［7］。本试验在2013-2014年发病猪场采集的病料中，应用在Vero细胞中添加胰酶的方法，且经过三重和二重RT-PCR检测方法及对其N基因测序表明，成功分离得到两株PEDV流行野毒株，并可在细胞中稳定传代。进化树分析表明，两株分离毒株均处于近年流行野毒株的G2-1亚群，且均与CV777毒株遗传进化距离较远。在近年活跃的G2-1亚群中，各国毒株均有分布。另外，我们亦在进化树中发现在2010年后，流行野毒在G1亚群也有出现，提示对经典毒株的防控仍不可忽视。

虽然国内研究人员从一些腹泻病例中分离获得野毒PEDV，但用动物回归试验以验证病毒对仔猪的致病性还不多。本试验证实ZH01-f7和ZH02-f6毒株能够引起新生仔猪发生典型的发病症状和致死过程，提示所分离PEDV为具有高致病性强野毒株。此结果与强毒株HN1303毒力相似［8］。我们亦在发病仔猪血清中检测到PEDV，说明PEDV野毒株可以引起病毒血症，此结果与Jung et al.［9］研究一致。虽然ZH02-f57毒株也诱导了同样的临床症状和致感染仔猪死亡，但出现临床症状及死亡时间也较晚，说明ZH02毒株经过细胞传代，毒力已有所下降。这可能是开发PEDV弱毒疫苗的有效途径。对新野毒株的生物学特性研究仍有待进一步开展，以期制备出更安全有效的针对流行毒株的候选疫苗。

［1］Pensaert M B，de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine［J］.Archives of Virology，1978，58（3）：243-247.

［2］Lee C.Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and reemerging epizootic swine virus［J］.VIROLOGY JOURNAL，2015，12：193.

［3］Boniotti M B，Papetti A，Lavazza A，et al.Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Discovery of a Recombinant Swine Enteric Coronavirus Italy［J］.EMERGING INFECTIOUS DISEASES，2016，22（1）：83-87.

［4］Saif L J.Coronavirus immunogens［J］.Vet Microbiol，1993，37（3-4）：285-297.

［5］Song D S，Yang J S，Oh J S，et al.Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3［J］. VACCINE，2003，21（17-18）：1833-1842.

［6］Zhang Q，Hu R，Tang X，et al.Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China［J］.ARCHIVES OF VIROLOGY，2013，158（8）：1631-1636.

［7］Sun R，Cai R，Chen Y，et al.Outbreak of Porcine Epidemic Diarrhea in Suckling Piglets，China［J］.EMERGING INFECTIOUS DISEASES，2012，18（1）：161-163.

［8］Wang Y，Gao X，Yao Y，et al.The dynamics of Chinese variant porcine epidemic diarrhea virus production in Vero cells and intestines of 2-day old piglets［J］.VIRUS RESEARCH，2015，208：82-88.

［9］Jung K，Kim J，Ha Y，et al.The effects of transplacental porcine circovirus type 2 infection on porcine epidemic diarrhoea virusinduced enteritis in preweaning piglets［J］.VETERINARY JOURNAL，2006，171（3）：445-450.

Confirmation of thePathogenesis of Two Wild Porcine Epidemic Diarrhea Viruses and Analyses of theN genes

MO Wei-yu，LUO Jun，MO Mei-jun，ZHAO Jing，ZHANG Qiong，ZHU Sheng-he，CHEN Hao，LIN Ying-yi，GUO Xiao-feng
（College of veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China）

Via inoculating contents from small intestines of diarrhea piglets from infected hog farms to the Vero cell with trypsin，and then confirmed by the observation of CPE and specific RT-PCR，two strains of wild type PEDV were isolated and designated as"CH/GDZH01/1311"（"ZH01"for short）and"CH/GDZH02/1401"（"ZH02"for short）.They belong to the G2-1 subgroup based on phylogenetic analysis of N genes.While the two isolates and ZH02-f57 were inoculated to 3-day-old piglets，a 100% mortality was observed.However clinical symptoms and deaths caused by ZH02-f57 were the latest.This study provides the foundation for the attenuated PEDV vaccine based on variant strains.

PEDV；isolation and identification；N gene；phylogenetic analysis；animal regression experiment

GUO Xiao-feng

S852.65+1

A

0529-6005（2016）09-0010-03

2016-03-24

莫炜钰（1991-），男，硕士生，主要从事动物微生物与免疫学研究，E-mail：weiyu_mo@163.com

郭霄峰，E-mail：xfguo@scau.edu.cn