ATRA对新城疫疫苗的体液免疫增强作用的研究

任　超，曹　威，张文波，金天明

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 西青 300384）

ATRA对新城疫疫苗的体液免疫增强作用的研究

任超，曹威，张文波，金天明

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 西青 300384）

为了研究全反式维甲酸（ATRA）对新城疫疫苗的体液免疫增强效果，本试验选取1日龄AA肉鸡作为研究对象，低剂量组和高剂量组分别灌服1 μmol/kg体重和5 μmol/kg体重ATRA，在7日龄和28日龄时对药物对照组、低剂量组、高剂量组通过滴鼻、点眼的方法免疫新城疫疫苗。在7、14、21、28、35、42日龄和49日龄，每组随机取7只鸡，称重，采集胸腺、脾脏、腔上囊和血清，计算胸腺、脾脏和腔上囊免疫器官指数，利用血凝抑制（HI）试验检测血清中新城疫抗体效价。结果表明，ATRA可以促进雏鸡免疫器官生长，提高雏鸡免疫器官指数和新城疫抗体效价，表明ATRA可以增强雏鸡的体液免疫应答，且5 μg/kg体重剂量ATRA对新城疫疫苗的体液免疫增强效果更显著。

ATRA；新城疫疫苗；体液免疫；免疫增强；免疫器官指数

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是维生素A的主要活性代谢衍生物，在免疫反应的调节与抑制肿瘤的发生方面起着重要的作用［1］。Kaufman等研究表明，维生素A稍有不足就会显著削弱疫苗在肠黏膜诱导的保护性免疫反应，而短期补充维生素A就可以完全恢复机体的肠道免疫力，而且能够促进效应性体液免疫反应和细胞免疫反应［2］。研究发现，口服或皮下注射的ATRA通过刺激皮肤引流淋巴结内的树突状细胞产生更多的ATRA并诱导嗜肠T、B淋巴细胞由肠外的淋巴组织归巢到肠黏膜部位［3-4］。在白血病小鼠模型中，ATRA和DNA疫苗联合应用能够有效的促进INF-γ的产生和杀伤性T细胞的产生［5］。可见ATRA能够有效的促进机体的黏膜免疫反应，并调动系统性免疫应答，协同提高机体的免疫力。因此，ATRA可以作为潜在的免疫增强剂，在畜禽疫苗免疫中发挥良好的免疫增强作用。本研究将ATRA配合新城疫Ⅳ系疫苗，探索ATRA对家禽体液应答的作用，为研发安全高效的禽用免疫增强剂开辟新的道路。

1　材料与方法

1.1实验动物1日龄AA肉鸡196只，购自天津景盛源实验动物销售有限公司。

1.2主要试剂ATRA（美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝科技有限公司）；新城疫Ⅳ系疫苗（哈药集团生物疫苗有限公司）；新城疫标准阳性血清、新城疫标准阴性血清（中国兽医药品监察所）。

1.3主要仪器离心机（上海医疗仪器厂，LW-250A），振荡器（金坛市龙盛实验仪器厂，ZW-A），排枪（百得实验室仪器（苏州）有限公司，725010）。

1.4免疫程序制定ATRA用DMSO溶解，浓度为0.1 mg/L，-80℃保存。各组均为49只AA肉鸡，在1日龄时，高剂量组和低剂量组分别灌服5 μmol/kg体重和1 μmol/kg体重的ATRA，连续灌服7 d，药物对照组和免疫对照组分别灌服等量DMSO。在7日龄和28日龄时，高剂量组、低剂量组和药物对照组分别免疫新城疫Ⅳ系疫苗，免疫剂量106.0EID50/羽，免疫途径为滴鼻、点眼，免疫对照组免疫等量生理盐水。

1.5样品采集与处理在7、14、21、28、35、42日龄和49日龄，每组随机取7只鸡，翅静脉采血，称重，断颈处死，采集胸腺、脾脏和腔上囊，称重并计算免疫器官指数（免疫器官指数=免疫器官鲜重（g）/宰前活重（g）×100%）。将血液分离血清，利用血凝抑制（HI）试验检测血清中新城疫抗体效价。试验数据利用SPSS11.5软件进行统计与分析，图表用Graphad Prism软件绘制，以（D）表示。

2　结果

2.1免疫器官指数的测定脾脏免疫器官指数在14日龄时低剂量组显著高于免疫对照组（P＜0.05）；21日龄时高剂量组显著高于免疫对照组（P＜0.05）；28日龄时高剂量组、低剂量组均显著高于药物对照组（P＜0.05）；35日龄时各组差异不显著（P＞0.05）；42日龄时高剂量组、低剂量组均显著高于药物对照组（P＜0.05）；49日龄时高剂量组、低剂量组均显著高于免疫对照组（P＜0.05）（见图1）。所以ATRA可以促进脾脏生长，提高雏鸡脾脏免疫器官指数。

图1　脾脏免疫器官指数图

腔上囊免疫器官指数在14日龄和49日龄时各组差异不显著（P＞0.05）；21日龄时高剂量组极显著高于免疫对照组（P＜0.01）；28日龄时高剂量组极显著高于免疫对照组（P＜0.01），低剂量组极显著高于药物对照组（P＜0.01）；35日龄时高剂量组显著高于免疫对照组、药物对照组和低剂量组（P＜0.05），低剂量组显著高于免疫对照组（P＜0.05）；42日龄时高剂量组极显著高于药物对照组和低剂量组（P＜0.01）（见图2）。所以ATRA可以促进腔上囊生长，提高雏鸡腔上囊免疫器官指数。

图2　腔上囊免疫器官指数图

胸腺免疫器官指数在14日龄时高剂量组极显著高于免疫对照组（P＜0.01），低剂量组显著高于免疫对照组（P＜0.05）；21日龄时高剂量组显著高于免疫对照组和药物对照组（P＜0.05），低剂量组极显著高于免疫对照组（P＜0.01），低剂量组显著高于药物对照组（P＜0.05）；28日龄时高剂量组显著高于免疫对照组（P＜0.05）；35日龄时各组差异不显著（P＞0.05）。所以ATRA可以促进胸腺生长，提高雏鸡胸腺免疫器官指数（见图3）。

图3　胸腺免疫器官指数图

2.2新城疫抗体效价测定免疫对照组的新城疫抗体水平逐渐下降，而药物对照组、高剂量组、低剂量组的新城疫抗体水平在1免后逐渐上升，在28日龄（1免后21 d）达到高峰；2免后药物对照组、高剂量组、低剂量组的新城疫抗体水平继续上升，在42日龄（2免后14 d）第二次达到高峰，并维持至49日龄。新城疫抗体效价在14日龄时（1免后7 d）各组差异不显著（P＞0.05）；21日龄时（1免后14 d）高剂量组显著高于药物对照组（P＜0.05）；28日龄时（1免后21 d）高剂量组、低剂量组分别显著高于药物对照组（P＜0.05）；35日龄时（2免后7 d）高剂量组显著高于药物对照组（P＜0.05）；42日龄时（2免后14 d）高剂量组极显著高于药物对照组（P＜0.01），高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05），低剂量组显著高于药物对照组（P＜0.05）；49日龄时（2免后21 d）高剂量组极显著高于药物对照组（P＜0.01），高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05）。由此可见在ATRA的作用下，雏鸡的新城疫抗体效价显著提高，且高剂量组的抗体增长水平较其他组更显著（见图4）。

图4　新城疫抗体效价图

3　讨论

胸腺、腔上囊和脾脏是禽类最重要的免疫器官，其发育状态及机能强弱对禽类的免疫水平有很大的影响，免疫器官的重量相对增加，说明机体的免疫机能增强［6］。从结果可知，ATRA能够促进胸腺、腔上囊和脾脏的生长，提高机体的免疫机能，促进体液免疫反应。

ATRA通过大量表达核视网膜酸受体（RARα，-β和γ）产生信号，促进多种免疫细胞的发育和分化，增强T细胞分化，上调T细胞归巢受体的表达，促进sIgA分泌型细胞的发育，ATRA在黏膜免疫反应中发挥重要的作用［7］。同时，ATRA也是维生素A衍生物中最强有力的恢复体液免疫反应的活性物质，可以增强Th2型细胞的分化，抑制Th1型细胞的分化，促进基因免疫诱生Th2型免疫应答，抑制Th1型免疫应答，从而改变基因免疫，诱生特异性体液免疫反应［8］。本试验不同浓度ATRA对新城疫疫苗的免疫效果影响，从结果可知，ATRA可以提高新城疫的抗体效价，增强体液免疫应答，且5 μg/kg体重剂量ATRA对新城疫疫苗的免疫增强效果更显著。

［1］刘爽，汤锋，刘琦，等.全反式维甲酸对卵巢上皮腺癌细胞株抑制作用的实验研究［J］.中华临床医师杂志，2013，7（4）：1601-1604.

［2］Kaufman D R，De Calisto J，Simmons N L，et al.Vitamin A Deficiency Impairs Vaccine-Elicited Gastrointestinal Immunity［J］.J Immunol，2011，187（4）：1877-1883.

［3］Hammerschmidt S I，Friedrichsen M，Boelter J，et al.Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice［J］.J Clin Invest，2011，121（8）：3051-3061.

［4］Villablanca E J，Wang S，De Calisto J，et al.MyD88 and Retinoic Acid Signaling Pathways Interact to Modulate Gastrointestinal Activities of Dendritic Cells［J］.Gastroenterology，2011，141（1）：176-185.

［5］Kouichi F，Katerina P，Carole L P，et al.DNA vaccination with all-trans retinoic acid treatment induces long-term survival and elicits specific immune responses requiring CD4+and CD8+T-cell activation in an acute promyelocytic leukemia mouse model［J］.Blood，2010，115（3）：653-656.

［6］李亚杰，赵献军.益生菌、黄芪多糖微胶囊制剂对肉仔鸡生长性能、免疫器官指数及血液生化指标的影响［J］.安徽农业科学，2007，35（1）：100-103.

［7］Svensson M，Johansson-Linbom B，Zapata F，et al.Retinoic acid receptor signaling levels and antigen dose regulate gut homing receptor expression on CD8 T cells［J］.Mucosl Immunol，2008，1：38-48.

［8］喻三红，夏明灿，王立新，等.全反式维甲酸对基因免疫应答的调节作用［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（5）：337-340.

TheImmuneenhancement of ATRA in Humoral Immune Responsefor NewcastleDiseaseVaccine

REN Chao，CAO Wei，ZHANG Wen-bo，JIN Tian-ming
（Department of Animal Sciences and Veterinary Medicine，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

In order to study the immunity enhancement of ATRA for Newcastle Disease（ND）vaccine，1-day-old AA broilers were treated with ATRA at 1 mmol/kg and 5 mmol/kg respectively.At the 7thday and 28thday the drug control group，low dose group，and high dose group were immunized with ND vaccine by intranasal and eye immunization approach.At the 7th，14th，21st，28th，35th，42ndand 49thday 7 chickens in each group were randomly selected to be weighed，and the thymus，spleen，bursa and serum were collected for calculating the thymus，spleen and bursa immune organ index and detecting the ND specific antibody titers with HI test.The results showed that ATRA could promote the immune organ growth to improve the immune organ index and ND specific antibody titers.Meanwhile，ATRA also extended the duration of the ND specific antibody titers，indicating that ATRA enhanc the humoral immune response of chickens，and the immune enhancing effect for ND vaccine of the group treated with ATRA at 5 μg/kg was significantly differencet.

ATRA；ND vaccine；humoral immunity；immune enhancement；immune organ index

JIN Tian-ming

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）09-0019-03

2015-07-10

天津农学院科技发展基金项目（2013N09）；天津市高校“兽医生物技术”创新团队项目（TD12-5019）；天津市高等学校创新团队培养计划基金资助项目（TNTD2015015）

任超（1986-），女，实验师，硕士，研究方向为基础兽医学，E-mail：chaoren04050110@163.com

金天明，E-mail：jtm680@163.com