基于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合材料的电化学免疫传感器的构建＊

冷鹏，赵媛，刘素

（1.山东城市建设职业学院，济南 250103； 2.济南大学资源与环境学院，济南 250022）

基于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合材料的电化学免疫传感器的构建＊

冷鹏1，赵媛2，刘素2

（1.山东城市建设职业学院，济南 250103； 2.济南大学资源与环境学院，济南 250022）

构建一个基于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物（PB-CNTs-CNPs）增效的新型免疫传感器检测大肠杆菌。普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物能够增强电子的传递效率和电极的稳定性。当大肠杆菌抗存在时，辣根过氧化氢酶（HRP）标记的大肠杆菌抗体也通过特异性作用结合到PB-CNTs-CNPs修饰的金电极表面，形成一个夹心型结构。通过大肠杆菌抗体上标记的HRP酶催化底夜中双氧水的还原对大肠杆菌进行定量。该传感器具有很好的特异性、重现性和稳定性。在最优条件下，大肠杆菌浓度在10～1×107cfu/mL的范围内与该传感器的电流响应I存在I=33.68 lgCE.coli+7.19的线性关系，检出限为9.2 cfu/mL （S/N=3）。将该传感器应用于实际样品中大肠杆菌的检测，样品加标回收率为91.3%～103.0%，与平板计数法的实验结果相比较，结果具有高度一致性。

电化学免疫传感器；普鲁士蓝；碳纳米管；纳米金；大肠杆菌检测

大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，学名大肠希埃氏菌（E.coil），周身鞭毛，能运动，无芽孢，在自然界中分布十分广泛，尤其是在温血动物的肠道和粪便中大量存在［1］。致病性大肠杆菌被婴儿和幼畜（禽）摄入后可导致严重的腹泻和败血症，如非致病性大肠杆菌进入人体胆囊、膀胱等器官也可引起炎症，因而对食品、药品及饮用水中大肠杆菌菌群数进行检测是十分必要的［2］。传统的基于培养的大肠杆菌鉴定方法是简单的平板计数法，通常需要2～3天获得检测结果，费时且不能进行现场监测［3］。因此一些新的技术，例如酶联免疫吸附检测（ELISA）［4］、聚合酶链式反应（PCR）［5］、蛋白微量分析［6］、石英晶体微天平（QCM）体系［7］、表面等离子体共振（SPR）［8］、流式细胞术（FC）［9］和化学发光（CL）用以发展快速、灵敏的大肠杆菌检测方法，这些方法通常需要对样品进行预处理，仪器和试剂相对昂贵，对实验操作技术要求高。因此开发方便、高灵敏和低成本的检测方法很有必要。

电化学方法具有超出其它分析技术的优势，例如高的可移植性和可负担性、低功耗、快速的响应和低成本，尤其基于纳米材料检测大肠杆菌的方法吸引了广泛的关注［10］。纳米材料是纳米级结构材料（nanometer material）的简称，大致可分为4类：纳米粉末、纳米纤维、纳米膜和纳米块体。纳米材料因其特殊的构成而在光学、热学、电学、磁学力学以及化学方面具有许多普通材料无法比拟的优异特性［11］。碳纳米管与C60同属碳的同素异形体，内径可小至1 nm，外径一般在几纳米至十几纳米之间，直径与长度之比可达一百以上，属于纳米纤维，具有耐热性、耐腐蚀性、导电性强等特点，有“未来的材料”之美称，是典型的一维材料［12］。纳米金属与纳米材料中的纳米颗粒是最受关注的纳米材料之一，可与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性［13］。普鲁士蓝（Prussian blue）是一种深蓝色的染料，具有电活性，因曾为德国前身普鲁士军队制服的颜色而得名，别名滕氏蓝、中国蓝、亚铁氰化钾等［14］。

笔者制备了一个新型的电化学免疫传感器，用于高灵敏高特异性的检测大肠杆菌。该传感器通过自组装将抗体组装到普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物（PB-CNTs-CNPs）修饰的电极上，在夹心识别后，大肠杆菌由抗体上修饰的HRP催化底液中化学反应的信号进行定量。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

高速离心机：TGL-16C型，上海安亭科学仪器厂；

电化学工作站：VersaSTAT3型，美国阿美特克公司；

磁力搅拌器：MYP11-2型，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；

超净工作台：ZNC-1000/1500/1800型，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

电子天平：FA-B型，湖北好美佳仪器设备有限公司；

三电极系统：铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，修饰后的玻碳电极为工作电极；

多壁碳纳米管（AR，纯度大于95%）、过氧化氢（AR，纯度大于30%）、浓硫酸（AR，纯度大于98%）、氯金酸（AR，HAuCl4溶液质量分数为1%）、乙醇（AR，纯度大于99.7%）、对苯二酚（HQ）（AR，纯度大于97%）、铁氰化钾［K3Fe（CN）6］（AR，纯度大于99.9%）、三氯化铁（AR，纯度大于99.9%）、氯化钾（AR，纯度大于99.9%）、磷酸氢二钾（AR，纯度大于99.9%）、磷酸二氢钾（AR，纯度大于99.5%）、壳聚糖（黏度大于400 mPa·s）：阿拉丁（中国上海）有限公司；

大肠杆菌抗体：1 mg/mL，生工生物工程（上海）股份有限公司；

细菌学蛋白胨、细菌学琼脂、细菌学酵母粉：青岛日水生物技术有限公司；

磷酸缓冲液（PBS）：用磷酸氢二钾（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氢钾（NaH2PO4·2H2O）和NaCl配制；

牛奶：市售；

实验所用其它试剂均为分析纯；

实验室用水为超纯去离子水。

1.2实验步骤

1.2.1多壁碳纳米管的羧基化

称取200 mg的多壁碳纳米管（MCNTs）于烧杯中，加入160.0 mL的浓硫酸-浓硝酸混合液（3∶1）中，超声与加热搅拌交替进行6 h（加热需在通风橱中进行），直至混合液均匀。将制得液体倒入离心管，以10 000 r/min离心15 min后，倒去上清液加入去离子水水洗，继续离心，直到上清液呈中性，然后置于烘箱中于70℃干燥2 h，放入冰箱中保存，备用。

1.2.2纳米金的制备

将1 mL 1%的氯金酸溶液加入到100 mL去离子水中煮沸，将2.5 mL 1%的柠檬酸钠溶液快速加入到回流的氯金酸溶液中，继续回流0.5 h以上，直至溶液由浅黄色变为深红色。液体均匀无沉淀代表制备成功，冷却后放入冰箱中保存。

1.2.3普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物的制备

将4 mg羧基化的多壁碳纳米管在超声搅拌下分散到40.0 mL的0.01 mol/L FeCl3溶液中，加入FeCl3使其过量，边搅拌边将40.0 mL 0.01 mol/L的K3Fe（CN）6逐滴加入到FeCl3溶液中。将得到的溶液在10 000 r/min条件下不断离心，倒去上清液，直到上清液呈无色状态。沉淀物经收集、干燥，分散到质量分数为0.1%的4.0 mL壳聚糖水溶液中，从而得到修饰PB-CNTs的氨基基团，在10 000 r/min条件下离心去除剩余壳聚糖，将已完成氨基修饰的PB-CNTs在8.0 mL金胶体中，搅拌2 h，离心分离，把得到的纳米复合材料分散到2.0 mL去离子水中，放入冰箱中保存。

1.2.4电极的预处理

将玻碳电极依次在0.10 μm和0.05 μm的Al2O3抛光布上抛光，用去离子水进行冲洗。将其置于无水乙醇-水（1∶1）溶液中超声清洗，去除表面沾附的颗粒；配制含0.2 mol/L KCl和5 mmol/L K3Fe（CN）6的溶液，以该溶液为底液，采用传统三电极体系进行循环伏安检测，电位范围：-0.2～0.6 V；扫描速率：50 mV/s；扫描圈数：3。其中3圈循环伏安曲线重合，氧化还原电位差小于85 mV，则电极处理成功。扫描后电极用水冲洗后妥善保存。

1.2.5传感器界面的构建

分子印迹传感器的构建如图1所示。首先将新制备的普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物超声处理50 min，然后移取10 μL复合物至处理过的电极表面，自然晾干2 h以上。向修饰第一层复合物的电极表面滴加10 μL大肠杆菌抗体，干燥1 h，滴加大肠杆菌菌液，孵育完全，滴加10 μL HRP标记的大肠杆菌抗体，即得到目标免疫传感器。该传感器产生信号的原理是利用抗体上标记的HRP催化底夜中化学反应产生信号。采用的构建方式是夹心法，电极上大肠杆菌的量越多，则结合的HRP标记的大肠杆菌抗体的量也越多，产生的信号越强，利用此原理对大肠杆菌进行定量。

图1　基于纳米材料增效的大肠杆菌电化学夹心传感器的构建原理

1.2.6电化学测量

修饰电极的表征在含有5 mmol/L K3Fe（CN）6和0.2 mol/L KCl的水溶液中，通过循环伏安法（CV）完成。扫描速率：50 mV/s；电压范围：-0.2～0.6 V；其它实验通过差分脉冲伏安法完成，将修饰好的电极放入含3 mmol/L HQ和3 mmol/L H2O2的pH为7.5的PBS缓冲溶液中，电压范围：-0.17～0.17 V；扫描速率：5 mV/s。

2　结果与讨论

2.1电极修饰过程的循环伏安表征

通过循环伏安法对传感器的构建过程进行表征，见图2。由图2可知，由于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金可以促进电子传输，曲线b的氧化还原峰电流响应相比于曲线a裸电极的电流响应有明显的增加；曲线c与曲线b相比，电信号显著下降，这是因为大分子蛋白阻断了电极表面的电子传递；曲线d和曲线e分别是修饰了大肠杆菌和HRP标记抗体后的循环伏安曲线，电信号陆续下降，这是由于这些大分子物质进一步阻碍了电子传递，进而降低了电极的电流响应。同时这一现象说明有大分子物质修饰在电极上，使得电子传递速率降低，表明大肠杆菌和HRP标记的抗体成功的特异性结合到电极表面。

图2　电极修饰上各种物质后的循环伏安图

2.2反应底夜pH值对传感器电流响应的评估

分别配制pH值为6，6.5，7，7.5，8的PBS缓冲溶液，分别加入10 mg HQ和1 μL H2O2，超声10 min使其混合均匀，用差分脉冲伏安法检测，通过电流响应的变化来观察记录所构建的免疫传感器在不同pH值下的性能，如图3所示。

图3　反应底夜pH对传感器电流响应的影响。

由图3可知，在pH小于7.5时，随着PBS溶液pH的增加，电流相应也逐渐增大，但当pH高于7.5时，电流响应开始下降。因此选择7.5作为该大肠杆菌传感器的最佳pH值。

2.3大肠杆菌孵育时间的优化

构建的免疫传感器在不同孵育时间下的性能如图4所示，实验过程中除孵育时间分别为10，20，30，40，50，60 min外其它条件相同。由图4可以发现，电流响应随时间的增加而增大，一直到50 min表现下降趋势。结果表明，该免疫传感器在孵育时间为50 min时可获得最佳性能。

图4　大肠杆菌孵育时间对电流响应值的影响

2.4大肠杆菌标准曲线的绘制

为了研究构建的电化学传感器的分析性能，利用差分脉冲伏安法对其线性检测范围和检出限（LOD）进行测定。在优化的实验条件下，测定修饰不同浓度的大肠杆菌溶液时免疫传感器的电化学响应。用构建的传感器，大肠杆菌的浓度与响应电流存在I=33.68 lgCE.coli+7.19的线性关系，线性范围10～1×107cfu/mL。检出限的计算方法：测定空白时的电流响应为39.5 μA，加上3倍的3次测定结果的标准偏差，得到39.65 μA，将这一数字带入拟合的公式中，求得检出限为9.2 cfu/mL。

2.5干扰试验

以大肠杆菌（1.0×104cfu/mL）溶液为对比，干扰物浓度大于大肠杆菌菌液浓度，分别为1.0×105cfu/mL的枯草杆菌、酵母菌、放线杆菌，按照相同的修饰过程构建免疫传感器，考察传感器的响应电流，结果如图5所示。

图5　大肠杆菌的干扰试验

试验结果显示，在远大于大肠杆菌浓度的干扰物存在时，其产生的电流与空白相差无几，表明该免疫传感器具有良好的选择性。

2.6传感器的再现性、重复性和稳定性研究

对传感器的再现性、重复性和稳定性进行了研究，试验结果如表1所示。最优条件下（pH 7.5，大肠杆菌孵育时间为50 min）组建5支传感器，每支电极只检测一次浓度为1.0×104cfu/mL 的大肠杆菌溶液，得到电流响应的相对标准偏差为3.8%，表明传感器具有良好的再现性。组建1支电化学传感器，该传感器检测1.0×104cfu/mL大肠杆菌菌液5次，得到电流响应的相对标准偏差为4.1%。结果说明构建的传感器可以实现对大肠杆菌的重复性检测。制备3支传感器，室温保存2周，检测传感器的电流响应，得到的电流响应为原来的92%，说明传感器的稳定性良好。

表1　传感器的再现性、重复性和稳定性试验结果

2.7比对试验

使用实际样品对夹心式电化学免疫传感器测定大肠杆菌的可行性进行了测试。不同浓度的大肠杆菌菌液被加入到样本中，样本除了用缓冲溶液稀释外不做其它预处理。实验用经典的平板计数法统计了样本中的大肠杆菌数量，并与电化学免疫传感器所获得的结果进行了对比，结果见表2。

表2　实际样品中大肠杆菌的检测结果

从表2中可以看出，夹心式电化学免疫传感器获得的结果与平板计数法的结果展现了良好的的一致性。实验结果进一步证明了该方法的可行性。

3　结语

利用夹心式免疫传感器与纳米材料的优良特性，构建了一种可以灵敏检测大肠杆菌的电化学传感器。修饰在电极表面的普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物可以有效结合大肠杆菌抗体，增加大肠杆菌吸附量，进而提高电流响应，这使得所构建的电化学传感器的灵敏度有了大幅度的提高。基于免疫分析原理的传感器的夹心结构，赋予传感器高度的特异性。使用上述方法和材料构建的传感器不仅线性范围宽、检测限低，还具有良好的重复性和稳定性和高回收率，在本实验中已成功运用到实际样本的检测中。本传感器具有良好的可靠性，在实际检测中具有广阔的前景。

［1］ Ichi S E，Leon F，Vossier L，et al. Microconductometric immunosensor for label-free and sensitive detection of Gramnegative bacteria［J］. Biosens Bioelectron，2014，54∶ 378-384.

［2］ Shen Z Q，Wang J F，Qiu Z G，et al. QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157∶ H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold［J］. Biosens Bioelectron，2011，26∶ 3 376-3 381.

［3］ Fournier-Wirth C，Deschaseaux M，Defer C，et al. Evaluation of the enhanced bacterial detection system for screening of contaminated platelets［J］. Transfusion，2006，46 （2）∶ 220-224.

［4］ Li Y，Deng J，Fang L C，et al. A novel electrochemical dna biosensor based on hrp-mimicking hemin/g-quadruplex wrapped GOx nanocomposites as tag for detection of Escherichia coli O157∶H7 ［J］. Biosens Bioelectron，2015，63∶ 1-6.

［5］ Dharmasiri U，Witek M A，Adams A A，et al. Enrichment and detection of escherichia coli O157∶ H7 from water samples using an antibody modified microfluidic chip［J］. Anal Chem，2010，82∶2 844-2 849.

［6］ Maddalo G，Stenberg-Bruzell F，Gotzke H，et al. Systematic analysis of native membrane protein complexes in Escherichia coli［J］. J Proteome Res，2011，10∶ 1 848-1 859.

［7］ Jiang X，Wang R，Wang Y，et al. Evaluation of different micro /nanobeads used as amplifiers in QCM immunosensor for more sensitive detection of E.coli O157∶ H7 ［J］. Biosens Bioelectron，2011，29∶ 23-28.

［8］ Shen Z，Wang J，Qiu Z，et al. QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157∶ H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold［J］. Biosens Bioelectron，2011，26∶ 3 376-3 381.

［9］ Pinero-Lambea C，Bodelon G，Fernandez-Peria R，et al. Programming controlled adhesion of e.coli to target surfaces，cells，and tumors with synthetic adhesins［J］. ACS Synth Biol，2015，4（4）∶ 463-473.

［10］ Li N，Ma H，Cao W，et al. Highly sensitive electrochemical immunosensor for the detection of alpha fetoprotein based on PdNi nanoparticles and N-doped graphene nanoribbons［J］. Biosens Bioelectron，2015，74∶ 786-791.

［11］ Chris M G， James S. Nowick nanometer-scale water-soluble macrocycles from nanometer-sized amino acids［J］. J Org Chem，2010，75∶ 1 822-1 830.

［12］ Li Y，Liang L，Zhang C，et al. Isothermally sensitive detection of serum circulating mirnas for lung cancer diagnosis［J］. Anal Chem，2013，85∶ 11 174-11 179.

［13］ Tatiana G C，Foteini A K，George Z T，et al. In-situ suspended aggregate microextraction of gold nanoparticles from water samples and determination by electrothermal atomic absorption spectrometry［J］. Talanta，2016，151∶ 91-99.

［14］ Wang L，Tricard S，Yue P，et al. Polypyrrole and graphene quantum dots @Prussian blue hybrid film on graphite felt electrodes∶ application for amperometric determination of L-cysteine［J］. Biosens Bioelectron，2016，77∶ 1 112-1 118.

“十二五”期间质检仪器技术攻关取得重大突破

2016年质检科技大会不久前在北京召开，会议提出，到2020年要实现国家质量技术基础总体水平与国际“并跑”、部分技术领域实现“领跑”的发展目标。

国家质检总局副局长孙大伟在会上介绍，“十二五”期间我国质量技术攻关取得重大突破：获国际互认的国家校准和测量能力1 266项，位居世界第四；研制国际标准224项，国家标准1 299项；突破了碳排放和碳减排等认证认可技术；高等级生物安全实验室认可技术及标准达到国际先进水平；研发3 000余种快速高通量检测鉴定技术、试剂和标准物质，茶叶中653种农药多残留和化学污染物检测方法通过11个国家和地区30个实验室协同验证；大型承压设备不停机电磁无损检测技术达到国际领先水平；攻克特种设备长周期安全运行关键技术260多项，研制仪器装置43台套。

“十三五”期间，质检科技将在“十二五”基础上，围绕建设质量强国，实现国家质量技术基础总体水平与国际“并跑”、部分技术领域实现“领跑”的发展目标。具体而言，要建立新一代国家计量基标准体系，部分成果达到国际领先水平；研制和参与制订的国际标准数量要大幅增加；重点领域认证认可技术方案达到国际或区域领先；研究一批检验检测检疫核心关键技术，实现质检技术群体性国际突破。

（仪器信息网）

2016首批创新基金验收项目名单公布

2016年4月12日，2016年第一批科技型中小企业技术创新基金项目验收合格名单公布，本次共计1 584个项目通过验收。

据不完全统计，本次合格名单中共有57个仪器仪表、试剂耗材及相关项目，涉及类别有分析仪器、环境监测仪器、物性测试仪器、医疗设备及行业专用仪器仪表等。

（仪器信息网）

Electrochemical Immunosensor Based on Prussian Blue-Carbon Nanotuves-Gold Nanoparticles Composite for E.coli Detection

Leng Peng1， Zhao Yuan2， Liu Su2
（1. Shangdong Urban Construction Vocational College， Jinan 250103， China；2. School of Resources and Environment， University of Jinan， Jinan 250022， China）

A novel E.coli immunosensor based on Prussian blue-carbon nanotuves-gold nanoparticles （PB-CNTs-CNPs） composite was developed. PB-CNTs-CNPs composites were used to enhance the electroactivity and stability of the electrode. In the presence of target E.coli，horseradish peroxidase（HRP）-labeled antibody was captured on the electrode surface to form a sandwich-type system via the specific identification. As a result，E.coli detection was realized by outputting a redox current from electro-reduction of hydrogen peroxide reaction catalyzed by HRP. This sensor also showed good specificity， repeatability and stability. Under optimal conditions， the concentration of E.coli in the range of 10-1×107cfu/mL and the current response I of the immunosensor had linear relation with the linear regression equation of I=33.68 lgCE.col+7.19， the detection limit was 9.2 cfu/mL （S/N=3）. The developed immunosensor was applied to the detection of E.coli in real samples. It was found that the recovery of the biosensor was in the range of 91.3%-103.0%. These data obtained using this biosensor strategy is in good agreement with those obtained via the plate count method.

electrochemical immunosensor； Prussian blue； carbon nanotubes； gold nanoparticles； E.coli detection

O657

A

1008-6145（2016）03-0110-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.029

*国家863项目（2012AA101604）

联系人：刘素；E-mail∶ stu_lius@ujn.edu.cn

2016-03-05