章鱼肉碱标准样品的研制＊

谢全灵，张怡评，陈晖，洪专，陈伟珠，方华

（国家海洋局第三海洋研究所，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门 361005）

章鱼肉碱标准样品的研制＊

谢全灵，张怡评，陈晖，洪专，陈伟珠，方华

（国家海洋局第三海洋研究所，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门 361005）

研制了章鱼肉碱标准样品。以章鱼加工副产物为原料，通过提取、分离纯化制备高纯章鱼肉碱，采用红外光谱（IR）、高分辨质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）进行结构确证。样品分装成144瓶，采用离子色谱检测法进行均匀性、稳定性检验和定值分析。从样品中随机抽取15瓶进行均匀性检验，经F检验表明：在95%的置信区间内样品均匀性良好。在0～4℃条件下，经过24个月长期试验稳定性考察，结果表明样品稳定性良好。标准样品经国内8家具有分析资质的实验室进行协同定值，章鱼肉碱标准样品定值结果为99.49%，相对扩展不确定度为0.14%（k=1.96）。该标准样品达到标准样品的技术要求，可用于章鱼肉碱相关产品的质量控制和分析方法校正。

章鱼肉碱标准样品；均匀性；稳定性；定值；不确定度

章鱼肉碱（Octopine）又名章鱼碱，在自然界中主要存在于章鱼、乌贼、鱿鱼、扇贝等海产软体动物中，由精氨酸与丙氨酸或丙酮酸在酶的作用下缩合而成，具有重要的生物活性功能［1-3］。研究发现，章鱼肉碱是导致章鱼、扇贝等味道鲜美的原因之一；章鱼肉碱有助于降低小鼠血液中总胆固醇和VLDL，LDL胆固醇的水平，同时增加小鼠血液中HDL胆固醇水平［4］；对比研究揭示喂食章鱼肉碱可显著提高小白鼠的交尾次数及妊娠概率［5］。此外，章鱼肉碱还是一种表征品质和新鲜度的指示剂［6-7］，可以应用于食品质量监控及安全等方面。目前，国内外未见章鱼肉碱标准样品研制的报道。笔者以章鱼加工副产物为原料，通过提取、分离纯化获得高纯章鱼肉碱单体，研制了标准样品，为深入开展相关研究提供物质基础。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

离子色谱仪：Dionex ICS-3000型，配备积分脉冲安培检测器，美国Dionex公司；

红外光谱仪：Bruker VERTEX 70型，美国Bruker公司；

高分辨质谱仪：Q-Tof micro 型，美国Waters公司；

核磁共振仪：Bruker 400 MHz型，美国Bruker公司；

天平：AL/104型，瑞士梅特勒-托利多集团；盐酸、醋酸钠、氢氧化钠：分析纯；实验用水来自Milli-Q纯水系统。

1.2章鱼肉碱样品的制备

以章鱼加工副产物为原料，经浸提、膜分离等步骤后获得粗品，再采用色谱分离、浓缩、干燥等精制方法获得纯度不小于99%的章鱼肉碱［8］。

1.3定性与定值分析

采用红外吸收光谱、高分辨质谱及核磁共振谱等对章鱼肉碱标准样品进行定性分析。采用离子色谱法对章鱼肉碱样品定值检测。

1.4色谱条件

色谱柱：Dionex AminoPac PA-10柱（250 mm×2 mm，10 µm，美国Dionex公司）；柱流量：0.24 mL/min；柱温：30℃；进样体积：25 µL；流动相：A为水，B为250 mmol/L NaOH溶液，C为1.0 mol/L NaOAc，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序

1.5样品溶液配制

打开章鱼肉碱样品瓶盖子后，精密称取章鱼肉碱适量，用超纯水配制成章鱼肉碱质量浓度约为8 µg/mL的溶液，按照1.4色谱条件进行纯度检测，每个样品重复进样3次。

1.6均匀性检验

按照GB/T 15000.3-2008［9］规定，本项目确定抽样数目为15个，采用单因素多水平试验方差分析法对章鱼肉碱标准样品进行纯度均匀性检验，测定方法采用上述的离子色谱检测法，每个样品重复测3次。检测数据用方差分析法进行分析以判断标准样品的均匀性是否合格。

1.7稳定性检验

为了考察样品的稳定性，确定其有效期，取本标准样品模拟上市包装，进行0～4℃条件下的24个月长期试验，分别于0，3，6，9，12，18，24个月末取样检测，通过考察标准样品纯度的变化来研究样品的稳定性。采用上述离子色谱检测法，每份样品连续进样2次，然后用归一法求出其纯度的平均值。

2　结果与讨论

2.1章鱼肉碱的定性分析

章鱼肉碱通过红外光谱、高分辨质谱及核磁共振谱进行定性分析。

2.1.1章鱼肉碱的红外光谱分析

将章鱼肉碱与溴化钾干燥后研匀，压片后放入红外光谱仪进行扫描，获得相应红外光谱数据见表2。表2详细列出了样品的红外光谱数据及归属。其中3 399，3 181，3 013 cm-1为羧基和胺基的伸缩振动；2 835，1 360 cm-1为亚甲基的伸缩振动和弯曲振动；1 687，1 631 cm-1为胍基的碳氮双键伸缩振动和—NH2的弯曲振动。

表2　章鱼肉碱红外光谱数据

2.1.2章鱼肉碱的高分辨质谱分析

高分辨质谱测得章鱼肉碱加氢离子精确质量数为247.140 1，与理论值（247.140 0）相符。

2.1.3章鱼肉碱的核磁共振谱分析

对该样品进行NMR测试，核磁数据见表3，与文献［10］报道的章鱼肉碱1H NMR和13C NMR图谱等数据一致。从样品的红外光谱、高分辨质谱和NMR谱证明了所研制的样品是章鱼肉碱，结构式见图1。

表3　章鱼肉碱的1H NMR和13C NMR数据（D2O）

图1　章鱼肉碱的化学结构式

2.2章鱼肉碱的定量分析方法选择

章鱼肉碱的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳分析、酶技术测定等，其中高效液相色谱法是最常用的一种方法。章鱼肉碱属于胍类化合物，存在极性大、紫外末端吸收等特点，此类化合物的定量检测常用柱前或柱后衍生高效液相色谱法［11-13］。由于章鱼肉碱含有氨基和羧基，可采用1，2-萘醌-4-磺酸钠、二苯乙醇酮［14］及茚三酮［15］作为衍生试剂，通过衍生化方法提高反相高效液相色谱法的准确度、灵敏度。目前，章鱼肉碱的检测方法尚无统一的国家标准或行业标准。离子色谱具有灵敏度高、分离度高、无需衍生化等优点，因此采用离子色谱对章鱼肉碱样品定值。

2.3均匀性试验

标准样品的均匀性检验是标准样品研制过程中不可缺少的程序，因此在对样品进行分装后，对章鱼肉碱标准样品进行纯度均匀性检验，均匀性检验结果见表4与表5。

表4　章鱼肉碱标准品纯度均匀性检验结果

表5　方差分析的结果

统计量F=MSamong/MSwithin=6.278×10-7/ 3.107×10-7=2.02，F（0.05，14，30）=2.04，F＜F（0.05，14，30），说明在95%的置信区间内，章鱼肉碱样品均匀性良好。

2.4稳定性试验

取本标准样品，模拟上市包装，在温度为0～4℃的条件下放置24个月，分别于0，3，6，9，12，18，24个月取样，按稳定性重点考察项目检测，试验结果见表6。根据GB/T 15000-2008《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求，采用直线模型作为经验模型，对长期稳定性获得的数据进行分析。

表6　章鱼肉碱样品在0～4℃储存条件下的稳定性

斜率：

直线上的点的标准偏差：

取其平方根s=0.0386135%，与斜率相关的不确定度：

自由度为n-2和P=0.95（95%置信水平），t0.95，n-2=2.571，t0.95，n-2s（b1）=2.571×0.001 863%= 0.004 790%，由于斜率，故斜率是不显著的，因而未观测到不稳定性。

长期稳定性试验结果表明，章鱼肉碱标准样品在0～4℃冷藏条件下保存24个月稳定性良好，所以样品的有效期可定为2年。

2.5定值结果及其不确定度评定

2.5.1定值结果

本标准样品按照GB/T 15000.3-2008标准要求，采用多个实验室协作定值，选择获得国家或部门认可的，具备资质的8家实验室进行样品定值。随机抽取8瓶样品，每个定值实验室送1瓶，采用上述的离子色谱检测法进行测定，应用面积归一法进行定值，定值结果见表7。

表7　定值结果汇总表

2.5.2定值结果的不确定度评定

根据GB/T 15000.3-2008标准规定，定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度UCRM由标准值定值试验的不确定度uchar、均匀性检验的不确定度ub和稳定性检验的不确定度ults组成。依据全部测定结果，计算章鱼肉碱标准样品的特性标准值和不确定度。

（1）标准值定值试验的不确定度：uchar=0.02%。

（2）均匀性检验的不确定度ubb。

瓶间方差：

式中的MSamong，MSwithin来自表5。

瓶间标准偏差是该方差的平方根：

（3）稳定性检验的不确定度ults

由2.3稳定性检验试验可知：

标准样品定值结果的不确定度：

扩展不确定度U95=ku=1.96×0.07%=0.14%。

通过统计学数据处理，章鱼肉碱标准样品的特性值定值结果为99.49%，置信度为95%的扩展不确定度为0.14%。

3　结语

研制了章鱼肉碱标准样品，对其进行了均匀性检验、稳定性考察，考察结果表明该标准样品符合标准样品均匀性与稳定性的要求。研制的章鱼肉碱标准样品对章鱼肉碱相关产品的测量和科学研究提供了技术支撑和量值溯源保证，具有重要意义。

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Development of Octopine Certified Reference Material

Xie Quanling， Zhang Yiping， Chen Hui， Hong Zhuan， Chen Weizhu， Fang Hua
（Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources， Xiamen 361005，China）

Abstrat Octopine certified reference material was developed. Octopine was made from the processing byproduct of octopus. The structure of octopine certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy （IR），high resolution mass spectral （HRMS） and nuclear magnetic resonance （NMR）. Octopine was divided into 144 bottles. The homogeneity and stability testing and quantitative analysis method were evaluated by ions chromatography. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 144 bottles，the sample homogeneity of inspection validated by F-test statistical methods within the 95% confidence interval was good. The stability inspection was carried on the long-term（24 months），and the results indicated that the period for octopine of storage was 24 months at 0 - 4℃. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of octopine was 99.49% with the relative expaned uncertainty of 0.14 % （k=1.96）. The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. The material was intended for use in the method validation and quality control regarding octopine.

octopine； certified reference material； homogeneity； stability； certification； uncertainty

O656

A

1008-6145（2016）03-0004-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.001

*厦门市科技计划项目（NO.3502Z20130004）；海洋公益性行业科研专项（201205022-8）；广东海洋经济发展区域示范项目（GD2012-D01-001）

联系人：洪专；E-mail∶ hzh@tio.org.cn

2016-03-14