液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中甲硫威及其代谢物残留

吴成，金维政，赵志强，王蕾

（山东省农业环境保护和农村能源总站，济南 250100）

液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中甲硫威及其代谢物残留

吴成，金维政，赵志强，王蕾

（山东省农业环境保护和农村能源总站，济南 250100）

建立了蔬菜中甲硫威及其代谢物（甲硫威亚砜和甲硫威砜）残留的液相色谱/串联质谱检测方法。样品以乙腈提取，采用电喷雾正离子源（ESI+）和多重反应监测（MRM）模式测定，外标法定量。结果表明，甲硫威、甲硫威亚砜、甲硫威砜的质量浓度与对应的色谱峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r＞0.995，甲硫威和甲硫威亚砜的线性范围为0.001～0.1 mg/L、甲硫威砜的线性范围为0.006～0.1 mg/L，方法检出限和定量限分别为0.4～3.0 μg/kg和1.4～10.0 μg/kg。在10，50，100 μg/kg 3个添加水平下，甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜的回收率为71.0%～98.1%，测定结果的相对标准偏差为5.5%～9.9%（n=6）。该法简单、准确、快速、灵敏，符合法规残留限量监测要求。

液相色谱-串联质谱法；甲硫威；甲硫威亚砜；甲硫威砜；蔬菜

甲硫威属中等毒性杀软体动物剂，具有触杀和胃毒作用［1］。GB 2763-2014规定甲硫威残留为甲硫威及其代谢物（甲硫威亚砜和甲硫威砜）之和［2］。目前，我国国家标准GB/T 23214-2008，GB/T 20770-2008和农业行业标准NY/T 1679-2009可用于检测甲硫威［3-5］，出入境检验检疫行业标准SN/T 0527-2012可检测甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜［6］。甲硫威残留主要检测方法有液相色谱-柱后衍生荧光法［7］、气相色谱-质谱法［8］、气相色谱-串联质谱法［9-10］和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［3-6，11-15］，甲硫威亚砜和甲硫威砜残留检测文献报道方法为液相色谱-串联质谱法［6，11-15］。甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜用液相色谱-串联质谱法检测时，现有文献均选择加氢峰离子作母离子［3-6，11-15］。笔者研究发现，在相同的仪器工作条件下，相较于加氢峰离子，甲硫威和甲硫威砜的加铵峰离子信号更强且稳定。GB 2763-2014规定了蔬菜中甲硫威残留限量值，其中，抱子甘蓝、结球莴苣和马铃薯的限量值最低，为0.05 mg/kg［2］。目前，用LC-MS/MS检测甲硫威及其代谢物残留的文献集中于烟草与谷物［6，11-15］，未见蔬菜中甲硫威及其代谢物残留的检测方法。笔者以抱子甘蓝、结球莴苣和马铃薯作蔬菜代表，用LC-MS/MS开展蔬菜中甲硫威及其代谢物残留检测的研究，建立了甲硫威及其代谢物残留的快速确证检测方法。该法操作简单，快速、灵敏，精密度和回收率较好，适合蔬菜中甲硫威及其代谢物残留的确证和定量测定。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：LCMS-8040型，配电喷雾离子源（ESI），日本Shimadzu公司；

离心机：LDZ5-2型，北京京立离心机公司；

食品加工机：k600型，荷兰Philips公司；

均质器：T18型，德国IKA公司；

电子天平：JY2001型，感量为0.1 g，上海精密仪器公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

甲酸、乙酸铵、氯化钠：分析纯，上海化学试剂有限公司；

抱子甘蓝、结球莴苣、马铃薯：市售，依据SN/T 0527-2012［6］检测，以确保空白样品无甲硫威残留；

实验用水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

1.2标准溶液配制

用甲醇稀释甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜标准溶液为100 mg/L单标准储备液，置于-20.0℃冰箱保存，使用时用甲醇-水溶液（1+1）稀释至所需的浓度。

关于本组80例患者的扫描诊断情况，如表1所示。多层螺旋CT与MRI检查肺动脉栓塞显示率均为100%，图像质量较高，且多层螺旋CT扫描时间短于MRI（P＜0.05）。

1.3仪器工作条件

1.3.1液相色谱

色谱柱：Waters symmetry C18柱（150 mm×3.9 mm，5 μm，美国Waters公司）；柱温：40℃；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比为75∶25，含5 mmol/L乙酸铵）；流量：0.4 mL/min；等度洗脱；进样体积：1 μL；信号采集时长：8.0 min。

1.3.2质谱

电喷雾正离子源（ESI+）接口电压：4.5 kV；电喷雾负离子源（ESI-）接口电压：-3.5 kV；雾化气：3.0 L/min氮气；干燥气：15.0 L/min氮气；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：20 ms；延迟时间：3 ms；各监测离子对的质谱参数见表1。

表1　LC-MS/MS 测定甲硫威及其代谢物的部分参数

1.4样品处理

按GB/T 8855-2008 《新鲜水果和蔬菜取样方法》抽取抱子甘蓝、结球莴苣和马铃薯样品，取可食部分［16］，缩分、切碎、混匀，放入食品加工机中粉碎，制成待测样，置于-20.0℃冰箱中保存。称取样品15.0 g于50 mL具塞离心管，加入30.0 mL乙腈，用均质器以12 000 r/min均质2 min，加入5.0 g氯化钠，剧烈振摇2 min，以5 000 r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于100 mL烧杯中，以60℃水浴氮吹至近干，用甲醇-水溶液（1+1）转移定容至2.0 mL，过0.22 µm有机滤膜，待测。

2　结果与讨论

2.1提取溶剂的选择

对不同基质蔬菜样品，选取乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷为提取溶剂进行提取对比试验。结果发现，蔬菜富含水分，丙酮与水互溶，除去水分较困难；二氯甲烷易乳化与水相分层不明显，且二氯甲烷价格较高且毒性较大；乙酸乙酯提取色素较多；乙腈与水部分互溶，加入氯化钠后，乙腈层与下层饱和氯化钠溶液分层明显，氯化钠溶液能除去部分水溶性杂质。因此实验选取乙腈作为蔬菜中甲硫威及其代谢物残留检测的提取溶剂。

2.2质谱条件的优化

分别采用ESI+和ESI-对甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜进行母离子扫描。结果发现，ESI+模式下，甲硫威亚砜的加氢峰离子、甲硫威和甲硫威砜的加铵峰离子信号均较强且稳定，以相应离子作母离子，利用岛津LCMS-8040 Optimizer软件对甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜的子离子、四极杆预杆偏置电压（Q1和Q3）、碰撞池电压（CE）等参数进行优化，优化结果见表1。

用优化的色谱、质谱条件，在MRM模式下，进0.1 mg/L甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜混标1.0 μL，得总离子流图（TIC）见图1（峰保留时间与表1洗脱出峰顺序对应），计算定性离子与定量离子（基峰离子）信号强度比（丰度比，见表1），依据欧盟2002/657文件规定的质谱技术中相对离子强度的最大允许限度范围，结合样品色谱峰保留时间和扣背景质谱图，可确证样品中甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜的存在。

图1　甲硫威及其代谢物的总离子流图（TIC）

2.3净化条件的选择

选取氨基固相萃取柱（6 mL/1 000 mg）、石墨化炭黑氨基串联固相萃取柱（6 mL，500 mg GCB/500 mg NH2—）和基质分散固相萃取试剂盒（15 mL，400 mg PSA/400 mg C18/400 mg GCB/1 200 mg MgSO4）进行蔬菜基质样品乙腈提取液净化对比试验。结果发现，这3种净化手段效率都不高，操作步骤繁琐，对分析物的回收有一定影响。本实验样品前处理采取盐析、乙腈提取、离心和过有机滤膜，虽不能充分去除样品中色素、糖类和脂类，但不存在农药多残留测定中固相萃取时一些农药的吸附损失，并且当前LC-MS/MS仪器结构性能得到改进，具有较好的抗色素、糖类和脂类干扰能力，质谱仪进样系统、离子源及离子传输通道等的清洗很方便，样品杂质对仪器寿命的影响可以不计；另外，甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜为弱极性化合物，杂质对其电喷雾离子化影响较小，加上多反应监测正离子扫描模式的高选择性，不采取过固相萃取小柱或基质分散固相萃取试剂盒的净化手段，样品基质对分析物测定的干扰可忽略不计。本实验样品前处理方法，操作简单，回收率高，快速和经济，特别适合大批量样品农药多残留检测，是农业部蔬菜质量安全农药残留例行监测和风险评估推荐的LC-MS/MS样品前处理方法。

2.4方法的特异性

对于甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜，选择信号值较高的两组二级质谱离子进行定性定量分析，分析物都具有自己的特征二级离子，选择性极高。辅之色谱的分离，基质干扰已减至最低，可忽略不计。对照蔬菜基质空白样品和加标样品MRM图，显示没有干扰组分影响测定。

2.5线性回归方程、线性范围、基质影响及定量限

在仪器工作条件下，用按本实验方法制备的空白蔬菜基质溶液和甲醇-水溶液（1+1）将甲硫威及其代谢物混合标准储备液稀释成0.001～0.1 mg/L系列标准工作液，进行测定，以被测组分的峰面积（y）对其质量浓度（x，mg/L）作标准曲线。分别以3倍和10倍信噪比（S/N）计算方法检出限和定量限。表2列出了甲醇-水溶液（1+1）配制的甲硫威及其代谢物峰面积对其质量浓度响应的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限。表3列出了3种蔬菜基质溶液配制的标准曲线的线性回归方程。结果表明，3种蔬菜基质溶液和甲醇-水溶液（1+1）配制的标准曲线的线性回归方程没有显著差异，蔬菜基质对分析物测定的干扰可忽略不计，可采用甲醇水（1+1）配制的标准曲线对分析物进行定量。从表2可知，线性相关系数r＞0.995，甲硫威和甲硫威亚砜的线性范围为0.001～0.1 mg/L，甲硫威砜的线性范围为0.006～0.1 mg/L；方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.4～3.0 μg/kg和1.4～10.0 μg/kg。该方法检测灵敏度符合GB 2763-2014 对蔬菜甲硫威残留检测方法的要求。

表2　甲硫威及其代谢物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限

表3　蔬菜基质中甲硫威及其代谢物的线性范围、回归方程、相关系数

2.6精密度与回收试验

在蔬菜空白样品中添加甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜10，50，100 μg/kg 3个水平，按1.4处理样品，在1.3仪器工作条件下测定，每个水平重复测定6次，进行回收试验，结果见表4。

表4　甲硫威及其代谢物在蔬菜中的添加回收率（n=6）

由表4可见，蔬菜中甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜3个水平添加回收率为71.0%～98.1%，测定结果的相对标准偏差为5.5%～9.9%，说明本方法准确度和精密度均已达到GBT 27404-2008 《实验室质量控制规范食品理化检测》的残留分析要求。

2.7样品分析

用本实验方法对某批次市场抽检多种蔬菜样品进行分析，在一些蔬菜中检出甲硫威亚砜，含量在5～30 μg/kg之间，其典型MRM色谱图见图2。

图2　甲硫威亚砜MRM图

甲硫威亚砜两个特征离子对（242＞185和242＞122）均出现，且丰度比与标准品一致，定性判断是阳性，定量结果从MRM图峰面积校正为8.2 μg/kg。

3　结语

以乙腈作为提取剂，经盐析、离心和过有机滤膜净化，高效液相色谱-串联质谱法分析，成功地建立了抱子甘蓝、结球莴苣和马铃薯3种蔬菜中甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜残留的快速检测方法。该方法简单、快速，灵敏度高，确证性和实用性强，可作为抱子甘蓝、结球莴苣和马铃薯中甲硫威、甲硫威亚砜和甲硫威砜残留的确证定性和定量检测，将来可尝试推广于更多种蔬菜中甲硫威残留检测。

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Determination of Methiocarb and Its Metabolites Residues in Vegetables by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wu Cheng， Jin Weizheng， Zhao Zhiqiang， Wang Lei
（Shandong Station of Agro-environment Protection and Rural Energy， Jinan 250100， China）

A new method was established to determine methiocarb and its metabolites （methiocarb sulfoxide and methiocarb sulfone） residues in vegetables by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with acetonitrile. Electrospray positive ion source（ESI+），multiple reaction monitoring mode （MRM） and external standard method were applied to samples analysis.The calibration curves showed good linearity in the range of 0.001-0.1 mg/L for methiocarb and methiocarb sulfoxide，0.006-0.1 mg/L for methiocarb sulfone with the correlation coefficient r＞0.995，the detection limits and quantification limits were 0.4-3.0 μg/kg and 1.4-10.0 μg/kg，respectively. The method validation was carried out at 10，50，100 μg/kg，the recoveries were from 71.0% to 98.1%，and the relative standard deviations of determination results were from 5.5% to 9.9%（n=6）. The method is simple，sensitive and suitable for monitoring the maximum residue limits（MRLs） of methiocarb，methiocarb sulfoxide and methiocarb sulfone.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry； methiocarb； methiocarb sulfoxide； methiocarb sulfone； vegetable

O657.7

A

1008-6145（2016）03-0049-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.013

联系人：吴成；E-mail∶ wucheng7745@sina.com

2016-01-12