血管紧张素原基因AGT M235T多态性与脑白质疏松症相关性研究

孙丽伟，周卫东，刘承浩，杨　芳，王　君，汪　琦，任　歆，尹晓明，曾庆玉



血管紧张素原基因AGT M235T多态性与脑白质疏松症相关性研究

孙丽伟1，周卫东1，刘承浩1，杨芳1，王君1，汪琦1，任歆1，尹晓明2，曾庆玉2

目的探讨肾素血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)M235T基因多态性与脑白质疏松症(Leukoaraiosis,LA)的相关性。方法采用聚合酶链反应(PCR)及聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)及Sequenom系统检测,经头部MRI确诊的202例脑白质疏松症患者及105例经MRI排除LA的正常对照者AGTM235T基因多态性。结果脑白质疏松症患者AGTMT基因型及T等位基因频率与对照组有明显差异，两组间TT基因型差异无统计学意义。结论AGT基因MT基因型和T等位基因可能与脑白质疏松症的发病相关。

脑白质疏松症；基因多态性；血管紧张素原；脑小血管病

脑白质疏松症是脑小血管疾病的一种，其与认知障碍[1]、跌倒发作以及神经精神疾病[2,3]有密切关联，还可增加脑卒中的风险，严重影响老年人的健康和生活质量。目前脑白质疏松症的发病机制尚不明确，有研究提示脑白质疏松症是一种多基因遗传性疾病。RAS系统通过影响血管收缩、血压调节、血栓形成和血管壁的损伤，最终可能导致脑血管疾病。研究发现，AGT基因多态性不仅与高血压、冠心病密切相关,还参与缺血性脑损伤的病理生理过程。本研究应用PCR-RFLP技术检测AGT M235T基因多态性在脑白质疏松症患者及正常人群中的分布情况，来探讨其与脑白质疏松症的相关性。

1　材料与方法

1.1研究对象病例组于2013年3月-2015年6月本院神经内科收集的已确诊的脑白质疏松症患者202例，男73例，女129例，平均年龄(65.68±9.131)岁，来自同一地区，非1级亲属。入选标准：年龄在50～85岁之间，符合脑白质疏松症的诊断标准，经头部MRI扫描确诊。LA诊断标准：双侧大脑皮质下白质、侧脑室周围及半卵圆中心的散在或者弥漫性病灶，T1呈等信号或低信号，T2和FLMR呈高信号，DWI呈低信号[4]。排除标准：痴呆、帕金森、严重的全身系统性疾病、脑出血、脑梗死、颅脑肿瘤及其他遗传代谢性神经系统疾病病史等患者。对照组：同期本院通过招募的年龄在50～85岁,且经MRI排除LA的正常对照105例，男35例，女70例，平均年龄(59.66±6.83)岁。两组人群的排除标准一致。由两名神经内科医师根据Fazekas视觉等级评分法[5]对所有LA患者分别进行评定，两者评定结果不一致的再通过上级医师验证。Fazekas视觉等级评定标准：Fazekas 0级：无LA；Fazekas 1级：点状或片状病灶(单个病灶直径≤9 mm,簇状病灶﹤20 mm)；Fazekas 2级：病灶开始融合，但病灶之间并无桥状连接(单个病灶直径10～20 mm，簇状病灶直径>20 mm)；Fazekas 3级：单个或片状融合病灶直径≥20 mm。

1.2临床资料本研究已获得煤炭总医院伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。两组均采用统一调查表填写内容：年龄、性别、高血压、高脂血症、糖尿病等相关病史，同时进行血常规、血脂、空腹血糖、肝肾功能及颈部血管彩超等检查。

1.3试剂与方法

1.3.1基因组DNA提取采取所有受试者肘部静脉血2 ml于紫帽管中，-20 ℃保存。严格按照DNA提取试剂盒(美国Omega Bio-Tek公司提供)说明书上的步骤进行DNA提取。

1.3.2AGT引物在美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI)获得AGT基因组序列，ID号：183。引物设计及合成在中国上海生工生物工程有限公司完成。上游引物序列(FF)：5’ACCCTGGCCTCTCTCTATCTG3’。下游引物序列(RR)：5’AGCCACTTCCCCACTTCTCAAG3’。上下游引物之间共577 bp。突变位点在379 bp位置处。

1.3.3采用PCR-RFLP技术行PCR扩增PCR扩增体系：10×buffer(含Mg2+)5 μl；2.5 mmol dNTP 2 μl；10 μmol上游引物1 μl；10 μmol下游引物1 μl；模板DNA 2 μl；TaqDNA聚合酶0.5 μl；加ddH2O至终体积为50 μl。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，再以94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s的程序循环35次，最后在 72 ℃延伸5 min。PCR仪：YG96梯度PCR仪。扩增回收前凝胶图像(见图1)。

1.3.4扩增产物的纯化选用琼脂糖凝胶电泳法纯化回收。琼脂糖浓度为2%，取30 μl扩增产物加5 μl溴酚蓝上样，每排加一个Marker。电泳45 min，紫外分析仪下，将目的条带切下，用胶回收试剂盒回收，得到30 μl左右的纯化产物。取3 μl上样检测并记录。电泳仪：双稳定时电泳仪-DYY-8C(北京市六一仪器厂)；紫外分析仪：Biosens-SC-BO5(BioTop)。

1.3.5扩增产物的测序纯化后检测成功的样本进行BDT反应。依次加入测序酶、buffer、引物和纯化后的产物，行PCR仪扩增。扩增产物采用酒精纯化法，纯化后的产物加入HIDI混匀，上机(3730XL)测序。突变位点的测序图(见图2)。

1.4统计学方法采用SPSS 21.0 软件，两组间不同基因型比较和等位基因频率比较采用χ2检验，相对风险率以优势比(odds ratio,OR) 及其95% 可信区间(confidenceinterval,CI)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。计量资料应用t检验，分类资料应用χ2检验。等级资料应用非参数检验。

2　结　果

2.1AGT基因多态性所有DNA样本经上述PCR 和扩增产物测序后，应用Chromas 2软件读取扩增的AGT基因序列，可观察到AGT基因突变的3种类型：无突变型MM型(见图2)、纯合突变型TT型(见图3)、杂合突变型MT型(见图4、图5)。

2.2经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验表明，LA组和对照组两组AGT基因M235 T 多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。

2.3LA组和对照组AGT 基因M235 T多态性和等位基因频率比较(见表1)。LA组AGT基因MT基因型频率(33.2%对21%；χ2=5.220，P=0.022)及T等位基因频率(20.5%对13.33%；χ2=4.071，P=0.044)高于对照组，均P<0.05，差异有统计学意义。LA组AGT基因MM基因型频率(63.4%对76.2%；χ2=5.220，P=0.022)显著低于对照组，P<0.05，差异有统计学意义。两组相比，MT+TT(突变型)与MM(无突变型)显著性增高(χ2=5.209，P=0.023)P<0.05，差异有统计学意义。

2.4LA组与对照组的人口资料学及临床指标的比较(见表2)。与对照组相比，LA组年龄(t=-6.504，P=0.00)、高血压病(χ2=13.873，P=0.000)、冠心病(χ2=4.733，P=0.030)均P<0.05，显著性差异有统计学意义，因此，年龄、高血压病、冠心病可能是脑白质疏松症的危险因素。

2.5将两组可能危险因素进行Logistic多因素方差分析(见表3)，结果显示年龄(OR=1.092；95%CI：1.054～1.130；P=0.000)、基因突变(OR=1.754；95%CI：1.064～2.890；P=0.028)高血压(OR=2.019；95%CI：0.778～3.233；P=0.009)是LA的独立危险因素。行协方差分析排除年龄混杂因素后，该基因突变仍然与LA有相关性(P=0.015,95%CI：0.661～0.838)。

2.6AGT M235T基因多态性在LA不同分级间的比较因TT基因型分布频率较低，将TT基因型与MT基因型归为同组进行统计分析。对基因未突变组(MM型)与突变组(MT+TT型)与不同LA分级行Spearman相关分析，结果显示：相关系数r=0.145，P=0.011，P<0.05，提示基因突变与LA 严重程度显著相关，且成正相关关系。AGT基因突变各基因型在LA不同分级间的分布(见表4)。

表1　LA组和对照组 AGT 基因 M235 T 多态性和等位基因频率比较

与对照组比较*较*P<0.05

表2　LA组与对照组的人口资料学及临床指标的比较

与对照组比较*较*P<0.05

表3　两组间危险因素的Logistic回归分析

与对照组比较*较*P<0.05

表4　AGT基因突变各基因型在LA不同分级间的分布

图1　DNA目的片段凝胶图像

图2　无突变型MM型

(需观察的突变位点如箭头所示，FF序列为T碱基，RR序列为A碱基)

图3纯合突变型TT型(FF 突变处T碱基突变为C碱基，RR 突变处A碱基突变为G碱基)

图4杂合突变型MT型(FF 突变处T碱基突变为C碱基，RR 序列无突变仍为A碱基)

图5杂合突变型MT型(FF 序列无突变仍为T碱基，RR 序列：突变处A碱基突变为G碱基)

3　讨　论

脑白质疏松症，又名白质高信号(white matter hyperintensities,WMH)，是一种常见的神经影像学表现。研究提示LA是一种多基因遗传性疾病，文献报道其遗传率从55%～80%不等[6]。AGT M235T基因位于人染色体1q42～q43，该基因结构上至少存在16个多态性位点，位于第2外显子核苷酸第704 处胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)替代,最终导致编码产物第235 位氨基酸由蛋氨酸Met 突变为苏氨酸Thr，即 M235T，构成3种基因型：未突变型235MM、突变纯合型235TT和突变杂合型235MT。

本研究结果表明LA组的MT基因型和T等位基因明显高于对照组(P<0.05)，该结论体现了中国人群LA的AGT基因型分布特点及突变特征。国外一荟萃分析[7]，纳入了van Rijn、Schmidt、Sierra等6个研究[8～10]，分析显示AGT基因突变与LA无相关性，但该分析仅涉及欧、美洲一些国家，由于种族差异，该结论不能反映亚洲中国人群LA的AGT突变特点，且该荟萃分析样本量小，尚需更多及更大样本量研究来证实AGT基因突变与LA相关性问题。国内一荟萃分析[11]显示AGT 235T突变型可增加亚洲人群缺血性卒中风险,与白种人无关。故推测AGT MT基因型与T等位基因可能参与LA的发生，其机制尚不清楚。Stephen等及Lanz JR等[12]推测T等位基因通过升高血浆中血管紧张素原水平，间接使血管紧张素Ⅱ水平升高，后者使小动脉平滑肌收缩和血管平滑肌细胞的增生、肥大及脂质沉积，影响血压的同时可直接导致皮质下小血管硬化,继而引起皮质下及深层白质缺血性改变。

本研究发现LA发生与年龄、高血压病、冠心病等因素相关,年龄、高血压、AGT基因突变是LA发生的独立危险因素。Kuller和Grueter等的研究认为[13]，随着年龄的增长，脑小血管危险因素如动脉粥样硬化、颈动脉斑块、高血压等所致小动脉狭窄，而供应脑白质区域血管灌注压下降时，易造成脑白质缺血改变。本研究中LA患者AGT M235T基因突变与高血压病(MT基因型χ2=0.669，P=0.413；MT+TT基因型χ2=0.441，P=0.507)无相关性，故我们推测MT基因型可能是独立于血压高水平的LA的遗传学危险因素。Amelia等[14]也得出一致的结论。而Sierra等25例LA研究[10]，未得出AGTMT与LA的关联，可能因样本量过小所致。

在本研究中，我们所选择的是中国北京地区汉族人群，比较好的控制了遗传异质性对研究结果产生的影响，且本研究所选正常对照病例均经MRI检查，入排标准严格，样本同质性较好，能够比较真实的反映国人LA的遗传危险因素，通过对LA易感基因的筛查,可以在传统危险因素的检测基础上,更为准确地筛查LA发生的高危人群，从而采取针对性的预防及治疗措施。

[1]Assareh A,Mather KA,Schofild PR,et al.The genetics of white matter lesions[J].CNS Neurosci Thrapeut,2011,17:525-540.

[2]Debette S,Markus HS.The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging:systematic review and meta-analysis[J].BMJ,2010,341:c3666.

[3]牛宝丰,周卫东,刘长春,等.椎-基底动脉系统短暂性脑缺血发作患者脑白质变性的危险因素研究[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2015,24(1):46-48.

[4]Smith EE.Leukoaraiosis and stroke[J].Stroke,2010,41:139-143.

[5]Prins ND,Scheltens P.White matter hyperintensities,cognitive impairment and dementia:an updat[J].Nat Rev Neurol,2015,11:157-165.

[6]Lin Q,Huang WQ,Tzeng CM,et al.Genetic associations of leukoaraiosis indicate pathophysiological mechanisms in white matterlesions etiology[J].Rev Neurosci,2015,26(3):343-358.

[7]Paternoster L,Chen WT,Sudlow Cathie LM,et al.Genetic determinants of white matter hyperintensities on brain scans[J].Stroke,2009,40:2020-2026.

[8]Van Rijn MJ E,Bos MJ,Isaacs A,et al.Polymorphisms of the renin-angiotensin system are associatedwith blood pressure,atherosclerosis and cerebral white matterpathology[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2007,78(10):1083-1087.

[9]Schmidt R,Schmidt H,Fazekas F,et al.Angiotensinogen polymorphism M235T,carotid atherosclerosis,and small-vessel disease-related cerebral abnormalities[J].Hypertension,2001,38:110-115.

[10]Sierra C,Coca A,Gamez-Angelats E,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and cerebralwhite matter lesions in essential hypertension[J].Hypertension,2002,39:343-347.

[11]LiangBY,QinLL,Wei HJ,et al.AGT M235T polymorphisms and ischemic stroke risk:a meta-analysis[J].J Neurological Sci,2013,331:118-125.

[12]Lanz JR,Pereira AC,Leos PA,et al.Angiotensinogen M235T polymorphism isassociated with coronary artery disease severity[J].Clin Chim Acta,2005,362:176-181.

[13]Kuller LH,Margolis KL,Gaussoin SA,et al.Relationship of hypertension,blood pressure,and blood pressure control with white matter abnormalities in the Women’s Health Initiative Memory Study (WHIMS)-MRI trial[J].J Clin Hypertens,2010,12(3):203-212.

[14]Assareh AA,Mather KA,Crawford JD,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and brain white matter lesions in older australians[J].Am J Hypertension,2014,27:1191-1198.

Association of the polymorphism of angiotensinogen gene M235T leukoaraiosis

SUNLiwei,ZHOUWeidong,LIUChenghao,etal.

(DepartmentofNeurology,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China)

ObjectiveTo study the relationship between polymorphisms of angiotensinogen AGT(M235T)gene and leukoaraiosis.MethodsA case control study was carried out using 202 cases of leukoaraiosis(LA group) and 105 cases of control.The M235T polymorphisms gene were determined by polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (PFLP) technique and sequenom system test.ResultsThere was a statistical difference in AGT MT genotypes and T alleles frequency between leukoaraiosis group and control subjects.The difference of AGT TT genotypes between the two groups had no statistical significance.ConclusionThe mutation of AGT MT genotypes and T alleles frequency may be associated with leukoaraiosis.

Leukoaraiosis;Gene polymorphism;Angiotensinogen;Cerebral small vessel disease

1003-2754(2016)04-0303-04

2016-02-13；

2016-03-30

首都卫生发展科研专项(No.2011-6011-01)

(1.煤炭总医院神经内科，北京 100028；2.煤炭总医院影像科，北京 100028)

周卫东，E-mail：mtzyyneuro@163.com

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