川芎嗪对宫颈癌HeLa细胞免疫抑制作用的影响

张雯珂，陈亚琼

川芎嗪对宫颈癌HeLa细胞免疫抑制作用的影响

张雯珂，陈亚琼

目的：研究川芎嗪（LHC）对宫颈癌HeLa细胞免疫抑制的影响。方法：以LHC作用HeLa细胞后，培养48 h，离心后收集上清（LHC-S1），重悬，再次培养48 h，离心后收集上清（LHC-S2），重悬，再次培养48 h，离心后收集上清（LHC-S3）。以与LHC组相同条件培养未经药物作用的HeLa细胞作为对照，同样连续收集3次的培养上清（Control-S1、Control-S2、Control-S3）。用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清中转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素10（IL-10）的含量，紫外分光光度法检测前列腺素E2（PGE2）含量，噻唑蓝（MTT）法检测对植物血凝素（PHA）诱导的外周血单核细胞（PBMC）增殖及对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）细胞毒作用的影响，以流式细胞术（FCM）分析经及不经药物作用的HeLa上清对外周血淋巴细胞亚群表型的影响。结果：（1）对照组3次培养上清中TGF-β1、IL-10和PGE2A278 nm值差异均无统计学意义（P＞0.05）；LHC组3次培养上清中差异均有统计学意义（P＜0.05），TGF-β1逐渐降低，IL-10前2次相似，均低于第3次，PGE2A278 nm在第2次最低；除第2次的IL-10外，LHC组IL-10均低于相应对照组。（2）3次培养上清对PBMC增殖的抑制率和对CTL的杀伤率在对照组，以及对CTL的杀伤率在LHC组和LHC组与相应对照组间差异均无统计学意义（P＞0.05）；LHC组第1次培养上清对PBMC增殖的抑制率最低。（3）对照组3次培养上清、LHC组3次培养上清外周血淋巴细胞亚群表型之间差异均有统计学意义；与对照组相比，相应LHC组的前2次培养上清CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-升高（P＜0.05），CD4+CD25+降低，第3次之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：LHC可下调HeLa细胞分泌免疫抑制分子，减少免疫抑制分子对PHA诱导的PBMC增殖的抑制，降低CD4+CD25+表达，上调CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-，可在一定程度上逆转HeLa细胞的肿瘤免疫抑制。

川芎嗪；HeLa细胞；免疫耐受

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:348-352）

肿瘤细胞通过分泌转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素10（IL-10）及前列腺素E2（PGE2）等免疫抑制分子，逃避免疫监视是肿瘤发生发展的重要机制。已有实验证明HeLa细胞可分泌上述免疫抑制分子［1-3］。因此，寻找可下调宫颈癌免疫抑制分子分泌的药物，是宫颈癌免疫治疗的重要研究方向。川芎嗪是我国的传统中药，具有抗肿瘤作用［4］，对于其下调HeLa细胞免疫抑制分子分泌的研究，国内外报道较少，现将笔者的研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

海克隆生物化学制品（北京）有限公司生产，每升完全培养液（complete medium，CM）中含小牛血清0.1 L，青霉素1×105U、链霉素100 mg；标准胎牛血清为天津市灏洋生物制品科技责任有限公司产品；青霉素及链霉素为华北制药集团产品；胰蛋白酶、植物血凝素（PHA）、噻唑蓝（MTT）、TGFβ1及IL-10定量酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均为Sigma公司产品；分析纯二甲基亚砜（DMSO）、氢氧化钾（KOH）及甲醇为天津市永大化学制剂开发中心产品；盐酸川芎嗪（Ligustrazine Hydrochloride，LHC）注射液为北京市永康药业有限公司产品，国药准字H11020960，每支2 mL，40 mg/支，4℃避光保存，实验前用DMEM稀释至所需浓度；抗人CD25-FITC，CD-PE 及CD3-ECD抗体为BECKMAN COULTER公司产品；MK353型酶联免疫仪为芬兰Thermolabsystems产品；TU-1901型紫外分光光度仪为北京浦西通用仪器有限公司产品。

1.2 方法

PBMC浓度调整至2×106/mL，取250 μL接种于培养瓶，加入2 μg/mL PHA 250 μL，同时各瓶分别加入500 μL LHC-S1、LHC-S2、LHC-S3及Control-S1、Control-S2、Control-S3，37℃5%CO2饱和湿度中培养48 h后收集洗涤，重悬细胞后加入抗人CD3-ECD、CD25-FITC及CD4-PE单克隆抗体，各10 μL，室温下混匀孵育30 min，洗涤细胞。FCM检测阳性细胞百分率。阳性细胞抑制率=（对照组阳性细胞百分率-实验组阳性细胞百分率）/对照组阳性细胞百分率×100%。对照组为荧光标记相同的人PBMC无关同型IgG1为对照，设淋巴细胞门。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0软件处理，定量资料正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，结果进行方差齐性检验后，用成组设计两样本均数比较的单侧t或t′检验，以直线回归方程表示免疫抑制分子的含量。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫抑制分子TGF-β1、IL-10及PGE2含量及LHC作用与免疫抑制功能的关系以标准品浓度的对数值为横坐标，以ELISA法检测的A值为纵坐标，绘制TGF-β1、IL-10的标准曲线，直线回归分析显示，检测2种免疫抑制分子的直线回归曲线方程分别为：TGF-β1=0.081+0.099X（t=3.608，P＜0.05）；IL-10=-0.068+0.265X（t=4.583，P＜0.05）。PGE2A值见表1，3个对照组的TGFβ1、IL-10的含量及PGE2的A278值差异均无统计学意义（P＞0.05）；3个LHC组差异均有统计学意义（P＜0.05），3组的TGF-β1逐渐下降，除第2次的IL-10外，LHC组IL-10均低于相应对照组，PGE2A278 nm值在第2次培养后降低，而第3次培养后又升至第1次培养后水平。除LHC-S2组与Control-S2组的IL-10比较差别无统计学意义外，其余的LHC组均低于相应的对照组。

2.2 培养上清对PBMC增殖及对CTL杀伤活性的影响Control-S1和LHC-S1均对PHA诱导的PBMC增殖有抑制作用。LHC-S1对PBMC增殖的抑制率低于Control-S1（P＜0.05）；LHC-S2及LHC-S3 对PBMC增殖的抑制率与相应对照组相似（P＞0.05）。人外周血单核细胞正常杀伤对照组（无上清作用）的杀伤率为（68.74±4.67）%，与正常杀伤对照相比，Control组和LHC组均可显著抑制CTL的杀伤活性（P＜0.01）；与Control相应对照组相比，LHC各组对CTL杀伤活性的抑制作用无明显变化（P＞0.05）。见表2。

2.3 培养上清对PHA诱导的T淋巴细胞亚群的影响与PHA转化正常组（Control不含上清）CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-细胞百分率相比，Control-S1相应各组细胞百分率明显降低（P＜0.05），CD4+CD25+升高。LHC组3次培养上清外周血淋巴细胞亚群表型之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，相应LHC组的前2次培养上清CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-升高（P＜0.05），CD4+CD25+降低，第3次之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表1 LHC作用后的HeLa细胞培养上清中免疫抑制因子的浓度（±s）

表1 LHC作用后的HeLa细胞培养上清中免疫抑制因子的浓度（±s）

注：Control 3组及LHC 3组单因素方差分析的结果，多重比较见字母a，b，c标示，字母一致的组间差异无统计学意义，字母不一致的组间差异有统计学意义，P＜0.05；PS1～PS3为LHC组与相对应的Control组比较结果。

组别nTGF-β1（ng/mL）IL-10（pg/mL）PGE2A278 nm值Control-S1组3989.23±34.84a3.39±0.16a0.26±0.01aControl-S2组3976.96±68.32a3.43±0.16a0.26±0.04aControl-S3组3963.57±16.35a3.77±0.15a0.25±0.04aP 0.0760.0830.065 LHC-S1组318.79±2.37a2.98±0.12a0.15±0.04aLHC-S2组32.40±0.46b2.87±0.11a0.09±0.01bLHC-S3组30.60±0.03c3.23±0.12b0.14±0.04aP 0.0430.0380.049 PS10.0060.0430.049 PS20.0090.0670.008 PS30.0050.0390.034

表2 LHC作用后的HeLa细胞培养上清对PBMC增殖及对CTL杀伤活性的影响（%，±s）

表2 LHC作用后的HeLa细胞培养上清对PBMC增殖及对CTL杀伤活性的影响（%，±s）

注：Control 3组及LHC 3组单因素方差分析的结果，多重比较见字母a，b，c标示，字母一致的组间差异无统计学意义，字母不一致的组间差异有统计学意义，P＜0.05；PS1～PS3为LHC组与相对应的Control组比较结果。

组别n对PBMC抑制率对CTL杀伤率Control-S1组346.78±4.12a51.37±3.78aControl-S2组350.76±4.98a56.48±6.25aControl-S3组349.33±5.57a55.37±4.48aP 0.0630.073 LHC-S1组320.36±1.34a58.76±6.30aLHC-S2组348.48±3.57b54.73±4.21aLHC-S3组350.46±4.76b53.76±3.78aP 0.0080.061 PS10.0340.069 PS20.0760.077 PS30.0840.074

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在中国妇女中发病率居第2位，世界每年新发宫颈癌病例中，我国占1/3。临床治疗主要包括手术治疗、放疗及化疗。后两种治疗手段会对机体免疫系统产生持久而显著的影响。目前，宫颈癌的免疫治疗逐渐成为研究的热点。已有研究表明，宫颈癌像其他大多数肿瘤一样，可以通过分泌免疫抑制分子抑制免疫活性细胞的增殖、分化及活化，封闭细胞传导通路，影响机体免疫应答。TGF-β1［1］、IL-10［2］及PGE2［3］是其中发挥主要作用的免疫抑制分子。

注：Control 3组及LHC 3组单因素方差分析的结果，多重比较见字母a，b，c标示，字母一致的组间差异无统计学意义，字母不一致的组间差异有统计学意义，P＜0.05；PS1～PS3为LHC组与相对应的Control组比较结果。

本研究表明，宫颈癌HeLa细胞可以稳定分泌上述免疫抑制分子，以TGF-β1量最大，浓度2×105/mL 的HeLa细胞，37℃5%CO2饱和湿度中培养48 h TGF-β1浓度可达989.23 ng/mL，经LHC作用后，HeLa细胞所分泌的免疫抑制分子浓度呈下降趋势，以TGF-β1最为明显，因而所测试的3种免疫抑制分子中，TGF-β1为优势分泌的免疫抑制分子。研究表明，TGF-β1为目前已知的最主要的免疫抑制分子。而经再培养后，随着药物作用被洗脱，上清中免疫抑制分子呈逐渐上升趋势。可证明，经LHC作用后的培养上清可下调HeLa细胞免疫抑制分子的分泌。

本研究表明，经LHC作用后的HeLa细胞第1次培养上清，可以部分逆转抑制分子对PBMC增殖的抑制作用，但是随着LHC作用被洗脱，LHC-S2 及LHC-S3的培养上清这种作用明显减弱。PHA可诱导具有活性的T细胞进行转化，CD3+是淋巴细胞的主要成分，CD4+为辅助性T淋巴细胞，而CD25+是T细胞活化的标志，其表达率反应T细胞活化水平。CD4+CD25+Treg为免疫抑制细胞［5-7］。将HeLa细胞培养上清作用于上述淋巴细胞，发现其有免疫抑制作用，促使CD4+CD25-向CD4+CD25+Treg转化，抑制CD4+CD8+T细胞功能。经LHC作用后的上清可部分逆转这种免疫抑制现象，进一步说明LHC可下调导致免疫抑制分子的分泌。CTL细胞是肿瘤免疫的主要效应细胞。本研究以肿瘤细胞作为抗原，经含有IL-2的培养基反复刺激诱导获得特异性的CTL。本研究表明，HeLa细胞培养上清具有降低CTL细胞杀伤率的作用，但经LHC作用后的HeLa细胞培养上清对CTL细胞杀伤及诱导转化的抑制无明显改变，说明目前实验中所采用的LHC浓度不能逆转免疫抑制分子对CTL细胞杀伤及诱导转化的抑制。

LHC作为我国传统中药，具有促进一氧化氮生成、减少氧自由基及抗细胞凋亡的作用［8-10］，常被应用于心脑血管疾病的治疗，在肿瘤治疗中多用于辅助治疗，用于降调节免疫抑制因子少见报道。本研究表明LHC作用后，所培养的HeLa细胞培养上清可逆转PHA诱导的淋巴细胞增殖抑制及上调CD4+CD25-T细胞的百分率，这有可能为LHC抗瘤作用机制之一。

本研究发现LHC的抗瘤机制可能为：下调上清中TGF-β1、IL-10及PGE2的含量，即LHC下调了HeLa细胞分泌的免疫抑制分子，减少对PBMC增殖的抑制，同时通过某种机制降低CD4+CD25+表达，上调CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-，可在一定程度上逆转HeLa细胞的肿瘤免疫抑制。提示可在宫颈癌患者术前、术中及术后加用LHC，可能部分逆转宫颈癌免疫抑制，增强疗效，预防肿瘤复发。但免疫抑制分子如何引起免疫细胞表达的变化，这种机制目前尚未明确，有待进一步研究。

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The Immunosuppression of Cervical Carcinoma Cell Line HeLa after Inoculating by LHC

ZHANG Wen-ke，CHEN Ya-qiong.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of the Chinese People's Armed Police Force Logistics College，Tianjin 300162，China

Objective:To study the variation of immunosuppression of HeLa inoculated by LHC.Methods: HeLa was inoculated by LHC，for 48 h，the supernatants were collected（LHC-S1），after centrifuging the cells，and then adjusted the concentration of HeLa，inoculated for 48 h，centrifuged cells，collect the supernatants（LHC-S2），adjusted the concentration of HeLa，inoculated for 48 h，after centrifuging the cells collected the supernatants （LHC-S3）.Compared with the HeLa′s supernatant without LHC，which was inoculated in the same condition，collected the supernatant for 3 times（Control-S1，Control-S2，Control-S3），test the TGF-β1 and IL-10 by ELISA，PGE2by ultraviolet spectrophotometry，by means of MTT to detect the proliferation of PHA induce PBMC and antibody-dependent cellular cytotoxicity of CTL.Flow cytometry（FCM）to analyze the subpopulation of peripheral blood lymphocytes，which was inoculated by the supernatants.Results:（1）The TGF-β1，IL-10 and PGE2A278 nm of control group had no significant difference in statistics（P＞0.05）；in LHC-group the difference were statically significant（P＜0.05）；TGF-β1 gradually decreased，IL-10 was similarity in LHC-S1 and LHC-S2，less than that in LHC-S3，PGE2A278 nm was the minimum in LHC-S2；except in LHC-S2，IL-10 was less than the control group.（2）All the supernatants of the control group could inhibit the proliferation of PHA induced PBMC and cytotoxicity of CTL，had no significant statistic difference（P＞0.05），the inhibition to CTL in LHC group and corresponding control group had no significant statistic difference（P＞0.05）；in LHC group，the inhibition ratio in LHC-S1 was the lest.（3）All the supernatants could influence the expression of the subpopulation of lymphocyte，it had statistic difference（P＜0.05）；Compared with control group，the percentage of CD3+，CD4+，CD25+and CD4+CD25-increased in LHC-S1 and LHC-S2 group，the percentage of CD4+CD25+decreased（P＜0.05），in the LHC-S3 group，the difference was not significant（P＞0.05）.Conclusions:The immunosuppressive molecules of HeLa could be reduced by LHC；LHC could decrease the inhibition of the proliferation of PHA induce PBMC；LHC also could increase the percentage of CD3+，CD4+，CD25+and CD4+CD25-，reduce CD4+CD25+；LHC could reverse the immunosuppression of HeLa to a certain degree.

Tetramethylpyrazine；HeLa cells；Immune tolerance

2015-10-13）

［本文编辑 王琳］

300162天津，武警后勤学院附属医院妇产科