Fn14活化凋亡增强人上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感度的研究

吴安玥，邱丽华

·论著·

Fn14活化凋亡增强人上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感度的研究

吴安玥，邱丽华

目的：探讨成纤维细胞生长诱导因子14（Fn14）对人上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）细胞的顺铂（DDP）敏感度的影响及其可能机制。方法：蛋白质印迹（Western blotting）法检测EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表达情况，选择低表达Fn14蛋白的细胞株转染Fn14过表达质粒后，观察转染后细胞株的Fn14蛋白、凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表达情况。CCK-8法检测细胞增殖能力及DDP半数抑制浓度（IC50）。流式细胞学检测细胞凋亡。结果：人EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中，A2780/DDP细胞株Fn14蛋白表达水平最低。Fn14过表达质粒转染A2780/DDP细胞后，细胞内Fn14表达水平上调（P＜0.05）；细胞的增殖能力无变化，但细胞DDP的IC50显著降低（P＜0.05）。流式细胞学检测结果进一步显示Fn14可以增加DDP诱导的A2780/DDP凋亡细胞数目。同时，Western blotting结果显示促凋亡蛋白caspase-3表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降（P＜0.05）。结论：Fn14可能活化凋亡通路进而提高A2780/DDP细胞对DDP的敏感度。

卵巢肿瘤；成纤维细胞生长诱导因子14；顺铂；抗药性，肿瘤；细胞凋亡

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:335-339）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）死亡率占妇科恶性肿瘤的首位［1］，虽然肿瘤细胞减灭术联合铂类为主的化疗对80%的患者有明显临床疗效，但是大部分患者在初始治疗18～24个月左右复发，仅有10%～15%能获得长期缓解［2］。目前认为EOC患者因化疗耐药而引起肿瘤复发，是导致其5年生存率低下的主要原因之一［3-4］。故研究卵巢癌耐药机制，从而找到靶点来减少或者逆转卵巢癌铂类耐药，是改善卵巢癌预后的关键因素。成纤维细胞生长诱导因子14（Fn14）是Ⅰ型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族中的最小成员，其配体是肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（TWEAK）。Fn14在肿瘤的发生、发展、化疗耐药中发挥重要作用［5-6］。目前研究显示，Fn14通过激活核因子κB（NF-κB）通路介导胃癌、小细胞肺癌的化疗耐药［7-8］，但其在EOC铂类耐药中的作用不明。本实验拟研究Fn14在EOC顺铂（DDP）耐药中的作用及其相关机制，为进一步寻找遏制EOC细胞化疗耐药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 主要仪器及试剂改良型RPMI 1640细胞培养液（Hyclone公司）；FBS（Hyclone公司）；双抗（青霉素、链霉素，Hyclone公司）；兔抗人Fn14抗体、兔抗人caspase-3抗体、兔抗人Bcl-2抗体（Cell Signaling Technology公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；pcDNA3.1-Fn14质粒（广东省人民医院医学科学研究中心惠赠）；DH5α感受态菌（大连宝生物公司）；DDP（山东齐鲁制药有限公司）；无内毒素质粒提取盒（北京天根科技有限公司）；细胞凋亡试剂盒（BD公司）；细胞培养皿、培养板（Corning公司）；远红外荧光扫描仪（LICOR公司）；异丙醇、无水乙醇、氯化钠等均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.3 统计学方法采用Graphpad Prism 5软件处理数据，定量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人EOC细胞株中Fn14蛋白表达水平的比较

Western blotting结果显示在人EOC的SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP细胞株中，A2780/DDP细胞株内Fn14蛋白表达水平最低，故采用低表达Fn14蛋白的A2780/DDP细胞株为研究对象进行后续实验。见图1。

图1 各EOC细胞株中Fn14蛋白表达水平

2.2转染Fn14过表达质粒对A2780/DDP细胞株中Fn14蛋白表达水平的影响Western blotting结果显示，转染Fn14过表达质粒后的A2780/DDP细胞中Fn14表达水平较vector组升高，差异有统计学意义（t=7.147，P=0.002）。见图2。

图2 Fn14过表达质粒转染A2780/DDP细胞后，Fn14蛋白表达水平的变化

2.3 转染Fn14过表达质粒对A2780/DDP细胞DDP敏感度（IC50）的影响CCK-8法检测结果显示Fn14过表达质粒转染后，A2780/DDP细胞IC50由（46.450±0.922）μg/mL降至（24.368±0.352）μg/mL，差异有统计学意义（t=3.875，P=0.019），见图3A。这提示Fn14增加了细胞对DDP的敏感度。未加入DDP时，与vector组相比，Fn14过表达质粒转染组细胞OD450 nm值的变化差异无统计学意义（P＞0.05）；加入DDP（终浓度10 μg/mL）处理后，DDP对Fn14过表达质粒转染组细胞增殖抑制作用更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3B。这提示Fn14不影响细胞增殖，故Fn14促进DDP对A2780/DDP细胞增殖能力的抑制，非细胞增殖能力减弱所致。

2.4 Fn14对A2780/DDP细胞凋亡的影响流式细胞学检测显示，未加入DDP时，vector组和Fn14过表达质粒转染组总凋亡率均＜1%。当加入DDP（终浓度为25 μg/mL）处理24 h后，vector组和Fn14过表达质粒转染组的总凋亡率分别为（12.1±1.5）%和（27.3±2.5）%，差异有统计学意义（t=8.864，P=0.001）。提示Fn14促进DDP所诱导的A2780/DDP细胞凋亡。见图4。

2.5 转染Fn14过表达质粒对A2780/DDP细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响Western blotting结果显示，未加入DDP时，与vector组细胞相比，Fn14过表达质粒转染细胞中的caspase-3蛋白前体、caspase-3蛋白活化体、Bcl-2无明显变化。当DDP处理（终浓度为25 μg/mL）24 h后，转染Fn14过表达质粒的A2780/DDP细胞中的caspase-3蛋白活化体表达上调（t=3.411，P=0.027），Bcl-2蛋白表达下调（t=6.645，P=0.003），差异均有统计学意义。见图5。

图3 Fn14过表达质粒转染A2780/DDP细胞后，细胞增殖能力及DDP敏感度的变化

3 讨论

图4 A2780/DDP细胞株过表达Fn14后细胞凋亡的变化

Fn14是由129个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞浆区中包含有肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）的结合序列，当配体与Fn14结合后，通过TRAF活化激活核因子κB（NF-κB）、胞外信号转导激酶（ERK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（p38MARK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路，调控肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞的迁徙和侵袭能力、促进肿瘤血管生成、参与炎症反应等一系列生物学行为［9］。研究显示，Fn14在不同的肿瘤中发挥的生物学效应不尽相同，其可通过激活ERK信号通路促进非小细胞肺癌的侵袭转移［10］；可促进HER2和heregulin β1依赖的乳腺癌细胞的迁徙和侵袭［11］；而在子宫内膜癌中，Fn14则通过活化caspase通路促进肿瘤细胞凋亡［12］；Fn14·TRAIL融合蛋白可以诱导肝癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长［13］。Fn14在肿瘤耐药中也发挥重要作用，Kwon等［7］发现，Fn14通过激活NF-κB通路介导胃癌对5-氟尿嘧啶耐药的发生；Li等［8］同样发现Fn14通过激活NF-κB通路导致小细胞肺癌对化疗药物的耐药。本研究发现在人EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中A2780/DDP细胞Fn14蛋白表达水平最低，继而在A2780/DDP细胞中转染Fn14过表达质粒后发现细胞IC50明显降低，增加细胞DDP敏感度，这与在胃癌、非小细胞肺癌中Fn14促进肿瘤耐药不同。因Fn14不影响细胞增殖能力，所以Fn14增强DDP对 EOC细胞株增殖的抑制作用不是细胞增殖能力减弱所致，进一步证明Fn14可以提高A2780/DDP细胞的DDP敏感度，在卵巢癌细胞铂类耐药机制中发挥重要作用。

图5 A2780/DDP细胞株过表达Fn14后，细胞凋亡相关蛋白的变化

细胞凋亡是凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白（IAP）共同调控下发生的一种主动的细胞自杀行为。DDP等经典的抗肿瘤药物通过促进细胞凋亡发挥抗肿瘤效应，然而细胞抗凋亡能力增强如抗凋亡基因过表达或促凋亡基因丢失，可能导致肿瘤细胞产生耐药性，故细胞凋亡异常与EOC的DDP化疗耐药密切相关［14-15］。caspase是凋亡蛋白酶家族，通过选择性地剪切其底物蛋白完成自我活化和相互激活过程，最终通过下游效应分子caspase-3活化触发细胞凋亡。当caspase功能受到抑制时，机体细胞凋亡障碍，进而诱使EOC的发生和进一步进展［16］。Bcl-2是凋亡抑制因子，主要通过抑制线粒体释放细胞色素C来抑制细胞通过线粒体途径发生凋亡。研究表明，当EOC细胞Bcl-2蛋白表达增多，细胞凋亡减少，DDP耐药性增加［17］。本研究发现A2780/DDP细胞转染Fn14过表达质粒后，可以促进DDP诱导凋亡细胞数目增多，同时促进凋亡相关蛋白caspase-3蛋白的活化和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，进一步提示Fn14可能通过活化凋亡通路促进A2780/DDP细胞凋亡，进而提高A2780/DDP对DDP的敏感度。

综上所述，本研究探索了Fn14与EOC细胞耐药的关系，首次发现了Fn14可能通过活化凋亡增强人EOC细胞株对DDP的敏感度，为临床开创有效逆转EOC铂类耐药的治疗新途径提供了理论基础。

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Fn14 Enhances Cisplatin Sensitivity in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells by Regulating Apoptosis

WU An-yue，QIU Li-hua.Department of Obstetrics and Gynecology，Shanghai Key Laboratory of Gynecology Oncology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200127，China

QIU Li-hua，E-mail:lilyqiulh@126.com

Objective:To investigate the effects of Fn14 on regulating cisplatin（DDP）sensitivity in human ovarian cancer cells.Methods:Fn14 protein expression levels in SKOV3，CAOV3，OVCAR3，ES2，3AO，A2780 and A2780/DDP were detected through Western blotting.The expression of Fn14，caspase-3，cleaved caspase-3 and Bcl-2 were accessed by Western blotting in lowest expression of Fn14 cell line when transfected with Fn14 plasmid.The half cell lethal dose（IC50）of DDP and the ability of proliferation in A2780/DDP cells were assayed by CCK-8 kit.The ratio of apoptosis in A2780/DDP cells were determined by flow cytometry.Results:A2780/DDP cells exhibited the lowest expression of Fn14 in these cell lines.Fn14 transfer had no effect on the proliferation of A2780/DDP cells，whereas it could reduce the IC50 of DDP in A2780/DDP cells（P＜0.05）.When Fn14 was transferred，the apoptosis induced by DDP was increased in A2780/DDP cells，meanwhile，the expression of apoptosiscorrelated protein caspase-3 was up-regulated and anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated（P＜0.05）.Conclusions: Fn14 may increase chemosensitivity to DDP by apoptosis pathway in human epithelial ovarian cancer cells.

Ovarian neoplasms；Fn14；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Apoptosis

2015-12-10）

［本文编辑 王昕］

国家自然科学基金面上项目（81272884）

200127上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海市妇科肿瘤重点实验室

邱丽华，E-mail：lilyqiulh@126.com