大气细颗粒物PM2.5对雌性大鼠生育力损伤作用的研究

吴思雨，侯海燕，张利文，韩斌，吕琪，陈亚琼

·论著·

大气细颗粒物PM2.5对雌性大鼠生育力损伤作用的研究

吴思雨，侯海燕，张利文，韩斌，吕琪，陈亚琼

目的：观察大气细颗粒物PM2.5对雌性大鼠生育力的毒性作用。方法：采用气管滴注方法，将生理盐水、低、中、高剂量PM2.5混悬液对SD雌性大鼠染毒，以苯并［a］芘（BaP）溶液灌胃作为阳性对照。染毒时间为孕前15 d至孕后6 d，孕前15 d每3天称量1次雌鼠体质量。在孕6.5 d（GD6.5）处死大鼠，观察整肺外观，记录胚胎个数、子宫质量（含胚胎，称子宫连胚质量）。取静脉血测量重金属铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）、砷（As）、锑（Sb）含量。HE染色用于子宫及卵巢组织病理学检查。结果：与生理盐水组相比，高剂量PM2.5组大鼠体质量下降明显、肺部外观改变明显；随着PM2.5染毒剂量的升高，雌鼠的交配指数及GD6.5受孕指数下降；BaP组雌鼠的GD6.5受孕指数无变化，但GD19.5受孕指数下降；PM2.5低、中、高剂量组大鼠胚胎个数减少，子宫连胚质量下降；PM2.5低、中、高剂量组大鼠外周血As的浓度升高，As、Sb的浓度与大鼠胚胎个数呈负相关；未发现PM2.5低、中、高剂量组大鼠卵巢和子宫组织有明显的病理学改变。结论：PM2.5对雌性大鼠的生育力具有损伤作用，这与PM2.5表面载带的重金属As、Sb的毒性作用有关；BaP损害植入后胚胎的生存力。

空气污染物；生殖；金属，重；动物实验；PM2.5

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:258-262）

PM2.5是直径小于2.5 μm的一种颗粒物，其表面附着多种物质，与呼吸系统、心脑血管疾病的发生密切相关［1］。国外流行病学研究发现，PM2.5也是不良出生结局的危险因素，包括低出生体质量、早产等［2］，而关于PM2.5对女性生育力影响的研究甚少。笔者在前期研究中发现，天津地区采暖期空气污染较非采暖期严重，且采暖期受孕者发生胚胎停育的比例也相对较高，总悬浮颗粒物（total suspended particulates，TSP）的污染水平变化与胚胎停育的发生率变化一致［3］。并且PM2.5表面附着的多环芳烃类物质（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）对大鼠的卵巢功能有损伤作用［4］。目前国内外文献大多研究PM2.5表面附着物质的独立毒性效应，而对PM2.5的混合毒性作用研究甚少。本研究利用天津地区特定时段收集的PM2.5混悬液对大鼠进行染毒，观察PM2.5是否影响妊娠早期胚胎发育，为研究探讨PM2.5的生殖毒性提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 统计学方法所有资料采用SPSS 21.0软件进行处理，符合正态分布的定量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett法，检验水准α=0.05。不符合正态分布的定量资料用中位数（四分位数间距）［M（Q）］表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。血As、血Sb与胚胎个数相关性采用Spearman相关分析。GD19.5受孕指数组间比较采用Fisher确切概率法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 体质量分析在合笼前染毒的各个阶段，PM2.5高剂量组大鼠的体质量低于生理盐水组，差异有统计学意义（均P＜0.05），PM2.5低剂量组、PM2.5中剂量组、BaP组与生理盐水组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 PM2.5染毒后母鼠体质量情况［g，M（Q）］

2.2 交配与生育情况至GD6.5为止，5组雌鼠受孕指数分别为13、11、12、9、15，见表2。第2批又养了生理盐水组和Bap组，分别为6只和7只。妊娠时限延长至GD19.5，发现与生理盐水组［83%（5/6）］相比，BaP组大鼠的受孕指数［43%（3/7）］有下降的趋势，但差异无统计学意义（P=0.119）。

表2 雌鼠在GD6.5的交配指数与受孕指数例（%）

2.3 肺部外观与生理盐水组（图1 a，见封三）相比，PM2.5低、中、高剂量组大鼠的肺（图1 b，c，d，见封三）颜色晦暗，表面出现黑点、黑斑，且程度随着PM2.5染毒剂量增高而加重；BaP组大鼠（图1 e，见封三）无明显变化。

2.4 胚胎个数与生理盐水组大鼠相比，其余4组染毒组的大鼠胚胎个数均减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表3，图2（见封三）。同时测量了子宫连胚质量，发现与生理盐水组相比，其余4组染毒组的子宫连胚质量均小于生理盐水组，且PM2.5中剂量组、高剂量组与生理盐水组的差异有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 5组胚胎个数及子宫连胚质量统计结果

2.5 卵巢及子宫组织病理结果在5组大鼠的卵巢组织中，均可见各个发育阶段的卵泡和黄体，卵巢组织无病理改变，见图3 a～j（见封三）。5组大鼠的子宫组织中，可见子宫腔减小或消失，子宫内膜蜕膜化，子宫组织无病理改变，见图3 k～t（见封三）。

2.6 血液重金属含量结果5组大鼠血液中Pb、Hg、Cd、Sb浓度差异无统计学意义（均P＞0.05），As浓度有差异，与生理盐水组相比，PM2.5低、中、高剂量组大鼠血As浓度升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表4。且随着血As浓度的升高，大鼠胚胎个数呈减少趋势，两者呈负相关（rs=-0.405，P= 0.040）。虽然5组大鼠的血Sb浓度差异无统计学意义，但是随着血Sb浓度的升高，大鼠胚胎个数呈减少趋势，两者呈负相关（rs=-0.382，P=0.054），接近检验水准。高剂量组雌鼠体质量明显减轻，考虑到雌鼠体质量可能对胚胎个数产生影响，因此相关分析未纳入PM2.5高剂量组的数据。

表4 5组大鼠血液重金属浓度情况（μg/L）

3 讨论

近年来，国内外对于PM2.5及其成分的生殖毒性的研究较多，从流行病学角度，PM2.5及其成分是低出生体质量、早产、精子质量下降的危险因素［8］；动物实验发现PM2.5能够干扰大鼠睾丸生殖细胞的正常细胞周期［9］，小剂量PAHs就能引起小鼠胚胎吸收［5］。本实验通过观察PM2.5染毒孕鼠的早孕期胚胎个数，发现PM2.5能够引起早孕大鼠的胚胎个数减少，且随着PM2.5染毒剂量的增加，胚胎个数减少的程度加重。

同时也观察到，高剂量PM2.5染毒使大鼠体质量明显降低，且肺部改变程度重，对大鼠体质造成较大影响。这与严超等［10］的研究结果一致。因此，本实验中PM2.5高剂量组大鼠胚胎个数减少的原因，可能不只来自于PM2.5的毒性效应，还与大鼠体质量的明显下降有关，因此要审慎地看待这一结果。对于PM2.5低剂量组和PM2.5中剂量组，PM2.5染毒并未造成体质量下降，因此认为PM2.5低、中剂量组的生育力毒性效应更多的是因为染毒本身，可以忽略体质量对结果的影响。随着染毒剂量的增加，雌鼠胚胎个数有逐渐减少的趋势，但差异无统计学意义，而子宫连胚质量显示出同样的趋势且差异有统计学意义，这可能是因为两种指标的数值性质不同。对于衡量大鼠早孕期胚胎个数来说，子宫连胚质量可能是一种更为敏感的指标。笔者认为二者意义相同，故可以得出PM2.5可导致胚胎个数减少及胚胎质量下降的结论。

PM2.5是由多成分构成的复杂颗粒污染物，各个地区PM2.5的组份及比例不尽相同，天津地区PM2.5载带的主要成分包括SO42-，NO3-，NH4-，Cl-等水溶性无机离子，硅（Si）等地壳元素，锌（Zn）、铅（Pb）等重金属，稠环芳烃（InP）、蒽（Ant）、屈（Chr）、苯并荧蒽（BbF）等PAHs，以及其他的有机碳、元素碳［11］。目前关于PM2.5的生殖毒理学机制仍不明。研究表明重金属是PM2.5的主要毒性成分。Coelho等［12］通过给孕鼠皮下注射葡甲胺锑酸盐（meglumine antimoniate，MA），发现五价锑（SbV）可以透过胎盘，进入乳汁，并使活产率下降（P＜0.05），新生小鼠的体质量下降（P＜0.05）。Ince等［13］发现三氧化二砷（As2O3）灌胃染毒引起雄鼠精子浓度降低，睾丸组织出现氧化应激。Gerhard等［14］的临床研究显示，尿As水平与孕激素水平呈负相关，说明As对卵巢功能产生了影响。陈培飞等［15］发现，与国内外其他大城市相比，天津市大气颗粒物中重金属含量普遍升高；且PM10和PM2.5中重金属含量顺序均为Zn＞Pb＞铜（Cu）＞铬（Cr）＞镍（Ni）＞As＞Cd＞Hg。我们测量了大鼠血液中5种重金属的浓度。它们在人体血液中的正常值分别为：Pb＜100 μg/L、Hg＜7.2 μg/L、Cd 0.32～2.72 μg/L、As 0.4～12.0 μg/L、Sb［16］3.38～7.38 μg/L。其中，Pb、As、Cd、Hg均是天津市PM2.5上载带的主要重金属元素，对于另一元素Sb，据文献报道大气中的Sb来源于废物焚烧、化石燃料的燃烧、金属冶炼等［17］。结果发现只有As在染毒组大鼠的血液中浓度是升高的，超过人体血液正常值，且与胚胎个数呈负相关（P＜0.05）；其余4种金属的浓度均在人体血液正常值范围内，组间差异无统计学意义。其原因有待进一步研究。而Sb在低浓度下仍表现出与胚胎个数的负相关趋势，统计结果显示P值为0.054，接近检验水准。这可能是因为Sb主要积蓄部位在骨骼和毛发［18-19］，血Sb值缩小了组间的差异，但仍能间接反映出暴露的多少。结合文献与实验结果，笔者认为天津地区大气PM2.5载带的重金属As、Sb是PM2.5是导致雌性大鼠生殖毒性的主要成分。

本实验期望BaP组能够作为阳性对照组对早孕雌鼠产生一定损害，但与其他研究不同［4-5］，本实验未发现BaP引起GD6.5胚胎吸收，但延长妊娠时限至GD19.5，发现BaP组受孕指数较生理盐水组明显下降。这提示了BaP可能影响植入后胚胎的生存能力。

本实验在HE染色中未发现卵巢和子宫组织的病理学改变。那么PM2.5到底是通过何种机制使得胚胎个数减少呢？既往文献报道，Gerhard等［14］将111名复发性流产患者按病因分为3组：黄体功能不全、自身免疫抗磷脂抗体综合征、以及原发性反复流产患者，发现黄体功能不全组的尿汞含量最高，说明汞或许影响了她们的黄体功能，黄体功能不全将影响孕卵着床。Cai等［20］发现，当环境中钴的浓度超过100 μg/L，将使斑马鱼胚胎的存活率降低并出现畸形，氧化应激和凋亡也参与其中。Nakashima等［21］发现一定浓度的镉能引起小鼠胚胎畸形率和死亡率升高，且呈剂量-效应关系。Jurewicz等［22］发现PM2.5与二倍Y染色体、二倍21号染色体的出现都明显相关。因此笔者认为PM2.5的作用靶点可能在以下几处：排卵；着床前胚胎的生存力（染色体异常等）；着床过程（母体免疫失调、孕激素不足、子宫及胚胎蛋白表达异常等）。

综上所述，PM2.5具有生殖毒性，能够引起早孕期大鼠胚胎个数的减少及胚胎质量下降。PM2.5表面载带的重金属As是其主要毒性成分，Sb可能是其重要的毒性成分，其他重金属及PAHs的生殖毒性还有待更多研究证实。这为下一步研究PM2.5的生殖毒性机制、寻找可能的生物学效应靶点提供实验基础。

［1］Dockery DW，Pope CA 3rd，Xu X，et al.An association between air pollution and mortality in six U.S.cities［J］.N Engl J Med，1993，329 （24）：1753-1759.

［2］吴思雨，侯海燕，陈娟，等.PM2.5与不良妊娠结局［J］.国际妇产科学杂志，2016，43（2）：221-225.

［3］侯海燕，陈亚琼，王丹，等.天津地区主要空气污染物与胚胎停育关系的流行病学研究［J］.生殖医学杂志，2009，18（4）：370-375.

［4］梁婧，王华，侯海燕，等.五味子提取物对苯并［a］芘诱导的早孕期大鼠胚胎损伤的保护作用及凋亡机制研究［J］.中国药理学通报，2015，（3）：381-387.

［5］DetmarJ，JurisicovaA.Embryonicresorptionandpolycyclic aromatic hydrocarbons:putative immune-mediated mechanisms［J］. Syst Biol Reprod Med，2010，56（1）：3-17.

［6］Archibong AE，Inyang F，Ramesh A，et al.Alteration of pregnancy related hormones and fetal survival in F-344 rats exposed by inhalation to benzo（a）pyrene［J］.Reprod Toxicol，2002，16（6）：801-808.

［7］张秀武，李永华，杨林生，等.温控湿法消解ICP-MS测定全血中铅镉硒砷汞5种微量元素［J］.光谱学与光谱分析，2010，30（7）：1972-1974.

［8］Zhou N，Cui Z，Yang S，et al.Air pollution and decreased semen quality:a comparative study of Chongqing urban and rural areas［J］. Environ Pollut，2014，187：145-152.

［9］张琳，牛静萍，徐佳，等.大气细颗粒物PM2.5对大鼠睾丸组织细胞周期的影响［J］.生态毒理学报，2009，4（2）：271-275.

［10］严超，曹希宁，沈炼桔，等.汽车尾气来源PM2.5长期暴露导致大鼠多器官损害［J］.重庆医科大学学报，2015，（6）：844-849.

［11］李伟芳.天津PM2.5理化特性和含碳气溶胶的分布与来源研究［D］.天津：南开大学，2008.

［12］Coelho DR，De-Carvalho RR，Rocha RC，et al.Effects of in utero and lactational exposure to SbV on rat neurobehavioral development and fertility［J］.Reprod Toxicol，2014，50：98-107.

［13］Ince S，Avdatek F，Demirel HH，et al.Ameliorative effectof polydatin on oxidative stress-mediated testicular damage by chronic arsenic exposure in rats［J］.Andrologia，2016，48（5）：518-524.

［14］Gerhard I，Waibel S，Daniel V，et al.Impact of heavy metals on hormonal and immunological factors in women with repeated miscarriages［J］.Hum Reprod Update，1998，4（3）：301-309.

［15］陈培飞，张嘉琪，毕晓辉，等.天津市环境空气PM10和PM2.5中典型重金属污染特征与来源研究［J］.南开大学学报（自然科学版），2013，（6）：1-7.

［16］劳少泉，邓雪凝，唐学玲，等.佛山市三水区正常人群全血中13种重金属本底含量研究［J］.职业卫生与应急救援，2013，31（2）：59-63.

［17］Bloch P，Vanderborght B，Adams F，et al.Investigation of the emissions of an antimony metallurgical factory with transmission electron microscopy［J］.Int J Environ Anal Chem，1983，14（4）：257-274.

［18］龙泽云，刘吉星.某金矿环境中锑污染对人群健康影响的调查［J］.中国公共卫生，1991，7（9）：431-432.

［19］廖自基.微量元素的环境化学及生物效应［M］.北京：中国环境科学出版社，1992：480-488.

［20］Cai G，Zhu J，Shen C，et al.The effects of cobalt on the development，oxidative stress，and apoptosis in zebrafish embryos［J］.Biol Trace Elem Res，2012，150（1/2/3）：200-207.

［21］Nakashima K，Wakisaka T，Fujiki Y.Dose-response relationship of cadmium embryotoxicity in cultured mouse embryos［J］.Reprod Toxicol，1987，1（4）：293-298.

［22］Jurewicz J，Radwan M，Sobala W，et al.The relationship between exposure to air pollution and sperm disomy［J］.Environ Mol Mutagen，2015，56（1）：50-59.

Impairment of Airborne Fine Particulate Matters PM2.5 to the Fertility of Female Rats

WU Si-yu，HOU Hai-yan，ZHANG

Li-wen，HAN Bin，LYU Qi，CHEN Ya-qiong.Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（WU Si-yu，HOU Hai-yan，CHEN Ya-qiong）；Peking Union Medical College Hospital，China Academy of Sciences，Beijing 100730，China（HOU Hai-yan）；School of Public Health，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China（ZHANG Li-wen）；State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China（HAN Bin）；Institute of Disaster Medicine，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（LYU Qi）

CHEN Ya-qiong，E-mail:chenyq82@hotmail.com

Objective:To explore the toxicity of fine particulate matter（PM2.5）on the fertility of female rats.Methods: Adult female SD rats were randomly divided into 5 groups:saline group（as negative control），low-，middle-and high-dose PM2.5 groups，and BaP group（as positive control）.PM2.5 was given by trachea instillation and BaP was given by intra-gastric administration from 15 days pro-gestation to 6 days after gestation.On the gestational day 6.5（GD6.5），female rats were sacrificed.Lungs were observed by naked eye.Uterine weight and embryos counts were recorded.Vein blood was collected for detecting the concentration of blood heavy metals including lead（Pb），mercury（Hg），cadmium（Cd），arsenic（As）and antimony （Sb）.Tissues of uterus and ovaries were stained by HE.Results:Compared with the saline group，body weight of rats in the highdose PM2.5 group significantly decreased and the lung histology also changed.While the dose of PM2.5 raised，the mating and GD6.5 pregnancy index decreased nevertheless rats in BaP group showed no difference.Then GD19.5 pregnancy index of BaP group decreased apparently as compared with saline group.Embryos counts，uterine and embryos weight in three PM2.5 groups significantly reduced.The As level increased in the three PM2.5 groups，which negatively related to the number of embryos，as well as Sb level.There was no significant change in pathology of uterine or ovarian tissue.Conclusions:PM2.5 could impair the fertility of female rats，and the increased As and Sb levels could be related to the reproductive toxicity.BaP impairs the viability of implanted embryos.

Air pollutants；Reproduction；Metals，heavy；Animal experimentation；PM2.5

2016-01-29）

［本文编辑 王琳］

国家自然科学基金（81402691）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（15JCZDJC36000）

300162天津，中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科（吴思雨，侯海燕，陈亚琼）；中国医学科学院北京协和医学院（侯海燕）；天津医科大学公共卫生学院（张利文）；环境基准与风险评估国家重点实验室，中国环境科学研究院（韩斌）；中国人民武装警察部队后勤学院救援医学研究所（吕琪）

陈亚琼，E-mail：chenyq82@hotmail.com