扁平钳蛤性腺发育的组织学研究

范斌朋，王梅芳，刘　永，潘珍妮，于非非，余祥勇

（1.广东海洋大学水产学院，广东　湛江　524088；2.华南农业大学海洋学院，广东　广州　510642）

扁平钳蛤性腺发育的组织学研究

范斌朋1，王梅芳2，刘永1，潘珍妮1，于非非1，余祥勇2

（1.广东海洋大学水产学院，广东湛江524088；2.华南农业大学海洋学院，广东广州510642）

通过石蜡切片对扁平钳蛤进行性腺发育组织学观察，结果表明，扁平钳蛤雌雄性腺的发育都可分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期。增殖期为滤泡形成期，出现了精原细胞和卵原细胞，贴近滤泡壁分布；在生长期，性腺面积、滤泡数目和生殖细胞数目都明显增大，卵母细胞和精母细胞形成；成熟期雌性滤泡内充满卵细胞，其生发泡透亮，核仁清晰可见，雄性滤泡内充满着蓝紫色的精子，精子尾部聚集在滤泡中央，呈鲜红色；排放期滤泡破损，卵细胞和精子排放，性腺面积减小；休止期滤泡腔萎缩，基本无生殖细胞残留。扁平钳蛤生殖周期为一年，5—6月处于性腺发育增殖期；7—10月性腺进入繁殖期，包括生长期、成熟期和排放期；11月进入休止期；其他月份性腺基本不发育。

扁平钳蛤；性腺发育；组织学鉴定；生殖周期

扁平钳蛤（Isognomon ephippium）属于软体动物门（Phylum Mollusca）双壳纲（Bivalvia）珍珠贝目（Pterioida）钳蛤科（Isognomonidae）钳蛤属（Isognomon）。为热带、亚热带暖温性贝类，在我国主要分布于广东的阳江和湛江［1］，我国台湾地区、南沙群岛周边以及越南、菲律宾、印度洋等地也有少量分布［2-3］。扁平钳蛤拥有少见的蓝褐色珍珠层，且其分泌珍珠质机能旺盛、抗病性强，具培育色泽特异珍珠潜能。国内外关于扁平钳蛤的研究较少，主要集中在养殖参数、生存环境和抗病能力等［2-5］方面，关于扁平钳蛤组织学水平的鉴定和分析研究报道目前尚鲜见。扁平钳蛤作为一种具有人工养殖和育苗育珠价值贝类，其性腺发育时期和生殖周期的鉴定是人工育苗和养殖的重要依据。本研究通过组织学切片和显微镜观察，对扁平钳蛤的性腺发育时期进行组织学划分，并通过一年内每月1次的取样观察，探讨性腺发育周期，为扁平钳蛤生产和养殖提供理论依据。

1　材料和方法

1.1材料

实验用扁平钳蛤采自广东省阳江市东平镇允波湾附近海域野生贝，试剂包括波恩 Bouin's固定液、石蜡、酒精（体积分数100%、95%、90%、80%、70%、75%、50%）、二甲苯、染色剂、1%酸酒精、冰醋酸，主要仪器有灯箱、切片机、恒温水浴锅等。

1.2实验方法

将所采集野生贝用锥形笼暂养于东平镇允波湾实验基地，网笼吊养按生产上的常规方法进行，笼间距为1m，吊养于水深1.5m的水层。养殖时间为2015年5月至2016年4月。每月随机取1组扁平钳蛤（30只），养殖期共取12组扁平钳蛤。取其性腺，经 Bouin's液固定、酒精脱水、包埋等步骤后切片（5～7μm），经Ehrilich苏木精-伊红染色后脱水并封片，在徕卡显微镜下观察，于MC170HD成像系统下拍照［6］。用于制作切片的扁平钳蛤样品体重约 35g，壳长、壳高、壳宽分别为 5.5cm、5.3cm和0.8cm左右。

2　结果与分析

2.1性腺的组织学分期以及外部特征

扁平钳蛤性腺位于足上方，一层透亮的薄膜包裹着性腺以及整个内脏团；在消化盲囊表层，也有部分性腺分布。性腺成熟时，外观圆润饱满，近似椭圆形。滤泡是生殖细胞发育和成熟的主要场所，由末端膨大的生殖管形成，滤泡呈囊泡状，形状不固定，大小不一，由滤泡壁和滤泡腔两部分组成，滤泡间隙充满结缔组织。传统性腺组织学分期方法一般将性腺的发育分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期［7-8］等5个时期，本研究依此将扁平钳蛤的性腺发育亦分为5个时期，具体如下。

增殖期（Ⅰ）性腺开始形成期。肉眼可见一层薄而透亮的淡黄色性腺或浅白色性腺（图1：A、B），主要分布于消化腺的两侧以及消化盲囊的表层。切片观察结果，雌性性腺开始发育，滤泡逐渐形成，呈弯月状、圆形、椭圆形等，滤泡壁逐渐增厚。卵原细胞逐渐形成并紧贴滤泡壁。卵原细胞形状不规则，多呈椭圆形或圆形，直径约5μm左右；细胞膜界限模糊，细胞核相对偏大，直径约3μm，呈圆形，染色质凝集，核内不易观察到核仁（图1：C）。雄性结缔组织间开始出现滤泡，滤泡内出现精原细胞和初级精母细胞。精原细胞体积相对较大，着色较浅；初级精母细胞近圆形，体积较精原细胞小，着色较精原细胞深（图1：D）。

生长期（Ⅱ）性腺持续发育期，肉眼观察性腺较为明显。切片观察结果显示，雌性滤泡数量较增殖期多，卵泡内包含大量卵母细胞。卵母细胞形态多呈经典梨形，其一端向滤泡腔突出，另一端以卵柄与滤泡壁相连；核质比增大，细胞核透亮，形成圆形或椭圆形的生发泡；核内可见染色质疏松分布；核仁偏位，直径约3～4μm（图1：E）。同时，腔内开始出现少量成熟卵细胞，为圆形。生殖细胞逐渐充满整个滤泡腔。雄性滤泡数量显著增多，体积也明显变大，滤泡内主要为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和少量精细胞，滤泡腔较充盈、空隙缩小（图1：F）。

成熟期（Ⅲ）扁平钳蛤肥满，性腺颜色较亮，面积较大，此时挑破其表面薄膜，可见到深黄色卵子或乳白色精液流出。切片观察结果显示，雌性卵母细胞的卵柄逐渐变窄，大部分发生断裂并脱离滤泡壁进入滤泡腔中，成熟的卵母细胞占满整个滤泡腔，近圆形，直径约为50～60μm。生发泡体积随之增大，直径约25～30μm，居中，核膜清晰，着色较浅。核仁明显，直径约5μm，偏位，着蓝紫色（图1：G）。雄性精巢最为丰满，精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子自外向内依次排列，充满滤泡腔。少量精原细胞和精母细胞靠近滤泡壁分布，着色较浅。精子体积小，着蓝紫色，呈辐射状排列于滤泡中央，精子尾部聚集，着鲜红色（图1：H）。

图1　扁平钳蛤性腺切片Fig.1　The historical sections of gonad in I.ephippium

排放期（Ⅳ）性腺出现不同程度的萎缩，面积减小，颜色较暗，饱满度下降。切片结果显示，雌性性腺发育经过成熟期以后，成熟卵细胞大多数已完成排放，仅残留少量处于不同发育时期的雌性生殖细胞，并最终走向退化。滤泡性状不规则，出现不同程度的中空，有得甚至破裂（图1：I）。雄性精子大量的排放，滤泡腔出现程度不一的射线状空腔。滤泡壁残留一些发育稍晚的精原细胞和精母细胞，陆续发育成精子排放（图1：J）。

休止期（Ⅴ）性腺萎缩松弛，面积较小，甚至基本无法辨别，颜色偏白色。切片观察发现，雌性经过排放期后，滤泡内几乎观察不到雌性生殖细胞，滤泡壁变薄、塌陷并开始退化。休止期末期，结缔组织大量增生，滤泡彻底消失，性腺发育经历1个周期（图1：K）。雄性完成精子排放后，滤泡成为空腔，腔内所残余的各期精细胞也逐渐消失。休止期晚期滤泡消失，结缔组织大量增生，性腺发育完成 1个周期（图1：L）。

2.2生殖周期

本研究对每月所采60个扁平钳蛤的性腺进行切片观察，统计其性腺的发育程度，如表1所示。5、6月所采样品中，大部分个体（41.7%）处于性腺发育增殖期；7月36.7%个体进入生长期；8月份有18.3%处于生长期，26.7%处于成熟期；9月有3.3%处于生长期，41.7%处于成熟期，3.3%处于排放期；10月有6.7%处于成熟期，41.7%处于排放期；11月3.3%的样品处于成熟期，11.7%处于排放期；12月和来年1月大部分贝性腺不发育，只有少量个体处于休止期；2月、3月和4月未见性腺发育个体。从进入繁殖期（包括生长期、成熟期、排放期）的性腺比例看，5月和6月比例为0；7月升高到36.7%；8月继续升至45.0%；9—10月保持最高水平48.3%；11月下降至15.0%；从12月至来年4月，都无进入繁殖期性腺发现。

数据显示，扁平钳蛤在5—6月处于性腺发育增殖期，7—10月性腺逐渐饱满，进入繁殖期，11月性腺逐渐萎缩进入休止期，其余月份性腺基本不发育。可见，扁平钳蛤的生殖周期为一年期。

表1　扁平钳蛤性腺发育分期统计Table1　The statistics of the gonad development of I.ephippium

3　讨　论

3.1扁平钳蛤性腺发育的组织学分期

与传统的显微镜直接观察相比，性腺的组织学切片能更好地阐述性腺、滤泡、生殖细胞的形态特征和发生分布，鉴定贝类性腺发育情况，指导人工受精和养殖。王梅芳［9-10］等对栉江珧（Atrina pectinata linnaeus）性腺的形态结构进行了研究，徐宗芹［11］等描述了企鹅珍珠贝（Pteda penguin（Röding））性腺各个发育时期的形态特征及各种生殖细胞的发生分布，吕豪［12］等分析了太平洋牡蛎的性腺发育分期，林志华［13］等对文蛤的性腺发育周期进行了探讨，这些结果给贝类的生理代谢和繁殖育种研究提供了组织学基础。

扁平钳蛤是培育色泽特异珍珠的潜能品种，掌握其性腺发育情况是人工繁殖和育珠的前提条件。目前尚未见关于其性腺分期和生殖周期的报道。本研究通过组织切片和显微观察，将扁平钳蛤性腺发育分可分为5个时期，即增殖期、生长期、成熟期、排放期以及休止期，并归纳了各个时期的主要特征。增殖期为滤泡形成期，并出现了精原细胞和卵原细胞，贴近滤泡壁分布。在生长期，性腺面积、滤泡数目和生殖细胞数目都明显增多，卵母细胞和精母细胞形成。成熟期性腺发育最为饱满，雌性滤泡内充满圆形的卵细胞，其生发泡透亮，核仁清晰可见；雄性滤泡内充满着蓝紫色的精子，精子尾部聚集在滤泡中央，呈鲜红色。排放期滤泡破损，卵细胞和精子大量排放，性腺面积减小，性状不规则。休止期滤泡腔萎缩，基本无生殖细胞残留，滤泡退化难易分辨。以上性腺特征与栉江珧［9］、企鹅珍珠贝［11］、太平洋牡蛎［12］和文蛤［13］等存在一定的相似之处。

3.2扁平钳蛤的生殖周期

本研究数据显示，扁平钳蛤的生殖周期为一年期，5—6月为性腺发育增殖期；7—10月进入繁殖期（包括生长期、成熟期和排放期）；11月性腺逐渐萎缩进入休止期；其余月份性腺基本不发育。相关研究也在其他贝类中得以开展，闫斌伦等［124］发现，连云港海区的毛蚶性腺发育为一年，其繁殖盛期在7月中旬至8月中旬，排放期为7月至9月；林志华［13］等发现，文蛤的性腺发育周期亦为一年，1—3月为增殖期，4—5月为生长期，5—7月为其成熟期，8月之后进入排放期和休止期。可见，不同贝类性腺发育都存在5个时期，但性腺成熟的具体月份存在一定差别，这很大程度上归因于物种差异、地理分布、饵料投喂和养殖环境的变化［13-15］。

3.3雌雄同体问题

于非非等［16-17］指出，双壳贝类多为雌雄异体，少数个体存在雌雄同体及性反转现象。王梅芳等［9-10］研究表明，栉江珧一般为雌雄异体，但也存在雌雄同体现象。企鹅珍珠贝为雌雄异体，同时也观察到了企鹅珍珠贝的性别转化现象，相关报道指出，在其所取的128例企鹅珍珠贝中，仅发现1例为雌雄同体［11］。本实验共解剖240个扁平钳蛤，通过对其性腺切片的观察，并未发现扁平钳蛤存在雌雄同体个体，提示扁平钳蛤为雌雄异体贝类，可能不存在性转化现象。

4　结　论

本研究对扁平钳蛤雌雄性腺的发育进行组织学分期，分别为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期，各个时期的主要特征为：增殖期为滤泡形成期，出现精原细胞和卵原细胞，贴近滤泡壁分布；生长期，性腺面积、滤泡数目和生殖细胞数目都明显增多，卵母细胞和精母细胞形成；成熟期性腺发育最为饱满，雌性滤泡内充满卵细胞，其生发泡透亮，核仁清晰可见，雄性滤泡内充满着蓝紫色的精子，精子尾部聚集在滤泡中央，呈鲜红色；排放期滤泡破损，卵细胞和精子排放，性腺面积减小。休止期滤泡腔萎缩，基本无生殖细胞残留。

扁平钳蛤的生殖周期为一年期，5—6月处于性腺发育增殖期，7—10月进入繁殖期（包括生长期、成熟期和排放期），11月性腺逐渐萎缩进入休止期，其他月份性腺基本不发育。

［1］黄宗国.中国海洋生物种类与分布：增订版［M］.北京：海洋出版社，2008：418-452.

［2］李强勇.扁平钳蛤生物学特征及其海区养殖的初步研究［D］.湛江：广东海大学，2013.

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［17］LIAO C Y，XU Y F，WANG Y L.The procreation circle of Chlamys Atreri［J］.Journal of Shanchai Fisheries University，1983，7（1）：1-2.

（责任编辑：陈庄）

Histological Study on the Development of Gonad of Isognomon ephippium

FAN Bin-peng1，WANG Mei-fang2，LIU Yong1，PAN Zhen-ni1，YU Fei-fei1，YU Xiang-yong2
（Fisheries College，Guangdong Ocean University，zhanjiang 524088，China；Ocean College，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Isognomon ephippium，with special lurid pearl layer，is a potential aquaculture breed to cultivate special color special pearl.The historical identification of gonad development and reproductive cycle was important for breeding and pearl cultivation in I.ephippium.The development of gonad in I.ephippium was analyzed by histological sections technology.The data indicated that the development of both male and female gonads of I.ephippium was devided into the proliferation stage，increasing stage，maturation stage，breeding stage and suspensive stage，with specific characteristics of gonads and germ cells.In the proliferation stage，oogonium and spermatogonium were produced in new follicles.In increasing stage，the area of the gonads，the number of follicles and germ cells were increased obviously.Massive oocytes and spermatocytes existed in follicles.In maturation stage，the follicles were filled with oocytes，which had bright germinal vesicle，clear nucleolus，and sperms with red tails.In breeding stage，mature germ cells were released from damaged follicles.In suspensive stage，follicles were shrinked and no germ cells were found.The reproductive cycle of I.ephippium was one year，including proliferation stage from May to June，increasing stage from July to August，maturation stage fromAugust to September，breeding stage from September to October，suspensive stage from October to November.Most gonads did not grow from December to next April.

Isognomon ephippium； gonad development； histological identification； reproductive cycle

S917.4

A

1673-9159（2016）04-0001-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.001

2016-05-06

广东省海洋渔业科技推广专项项目（A201308A11、A201308A05）；广东海洋大学优秀青年骨干教师培养项目（2014004）；广东海洋大学博士启动基金（E15041）

范斌朋（1988—），男，硕士研究生，研究方向为海洋经济动物发育生物学。E-mail：806360059@qq.com

于非非（1980—），女，讲师，研究方向为贝类的遗传育种。E-mail：yufeifei2000@163.com

余祥勇，男，教授，研究方向为水产动物育种及养殖。E-mail：topearly@126.com